ESTUDIO DE LAS COMUNIDADES FUNGICAS DE LA FILOSFERA DE 
PINUS TAEDA L. (PINACEAE) I. VARIACION ESTACIONAL

STUDIES OF THE FUNGAL COMMUNITIES OF THE PHYLLOSPHERE OF
PINUS TAEDA L. (PINACEAE) I. SEASONAL VARIATION.

N. Venedikian, S. M. Bonaventura & A. M. Godeas

RESUMEN

Estudio de las comunidades fúngicas de la filósfera de Pinus taeda L. (Pinaceae) I. Variación Estacional. Las comunidades
fúngicas de las hojas son dinámicas en el tiempo y el espacio. Los patrones de variación espacial y temporal de su composición
reflejan el balance sucesivo de procesos poblacionales como inmigración, emigración, crecimiento y muerte de especies. La
micoflora de la filósfera de Pinus taeda L. se ha estudiado desde la acícula joven hasta la senescente, en primavera, verano,
otoño e invierno, utilizando métodos de lavado y cultivo. Se aislaron 49 taxa fúngicos de los cuales Pestalotiopsis oxyanthi,
Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, C. oxysporum, C. sphaerospermum, Nigrospora oryzae,
Epicoccum purpurascens, Hormonema dematioides y las levaduras son los más importantes en la filósfera de P. taeda. La
estructura de la comunidad fúngica se analizó aplicando análisis de componentes principales y análisis discriminante.
Principalmente en las comunidades fúngicas de las acículas jóvenes y senescentes se observaron variaciones estacionales. H.
dematioides y las levaduras caracterizaron a la comunidad fúngica de las acículas jóvenes en primavera y verano mientras que
P. oxyanthi lo hizo en otoño e invierno. Las levaduras y MDE1 caracterizaron a la comunidad fúngica de las acículas
senescentes en verano y P. oxyanthi en invierno.

Palabras claves: comunidades fúngicas, filósfera, Pinus taeda, variación estacional.

ABSTRACT

Studies of the fungal communities of the phyllosphere of Pinus taeda L (Pinaceae) I. Seasonal Variation. Fungal communities
of leaves are dynamic in time and space. The patterns of spatial and temporal change in their composition reflect successive
balances among the population processes of inmigration, emigration, growth and death for individual species. The phyllosphere
mycoflora of Pinus taeda L. has been studied from the newly expanded needles to the senescent stage in the spring, summer,
fall and winter seasons using serial washing and cultural method. Forty nine fungal taxa were isolated; Pestalotiopsis oxyanthi,
Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, C. oxysporum, C. sphaerospermum, Nigrospora oryzae,
Epicoccum purpurascens, Hormonema dematioides and the yeasts were the most important fungi in the P. taeda
phyllosphere. The structure of fungal community was analysed using Principal Component Analysis and Discriminant Analysis.
The community of young and senescent needles was mainly influenced by climatic conditions. H. dematioides and the yeasts
characterized the fungal communities of the young needles in spring and summer and P. oxyanthi in autumn and winter. The
yeasts and MDE1 were predominant in the senescent needles in summer and P. oxyanthi was in winter.

Keywords: fungal communities, phyllosphere, Pinus taeda, seasonal variation.

INTRODUCCION

Las comunidades fúngicas del filoplano son sistemas abiertos, dinámicos en tiempo y espacio. Los patrones de variación
temporal y espacial en la composición de microorganismos reflejan el balance sucesivo de procesos de inmigración, emigración, crecimiento y muerte en las poblaciones (Kinkel 1992). La regulación de la dinámica de la población y de la comunidad es diferente en los sistemas abiertos respecto a sistemas más cerrados como la rizosfera (Hughes 1990).

Andrews & Kinkel (1986) definen a las hojas como islas virtuales y reconocen analogías entre la colonización de ambas.

Los hongos saprobios que crecen en la superficie de las hojas constituyen un grupo especial de organismos generalmente
cosmopolitas (Kahlki et al. 1986), caracterizados por alta tolerancia al "stress", al disturbio y con distintos grados de
competencia interespecífica (Pugh & Boody 1988). Este grupo de hongos está involucrado en la resistencia de la planta a
insectos y patógenos, (Dubos & Bulit 1981) y en la descomposición de la hojarasca (Hudson 1971).

Son pocos los trabajos sobre la filósfera de especies de Pinus (Mishra & Das 1981; Kahlki et al. 1986 y Legault et al. 1989
a, b). El único trabajo realizado en Pinus taeda es el de Watson et al. (1974) pero el objetivo del mismo está centrado en la sucesión fúngica en la hojarasca. Sin embargo una evaluación de la diversidad microbiológica de la filósfera no sólo debe estar basada en la cuantificación e identificación de los microorganismos involucrados, sino que es esencial investigar el rol funcional a fin de definir el significado de la diversidad microbiana.

Para lograr una aproximación a la comprensión de las complejas relaciones entre los hongos y su ambiente, tanto biótico como abiótico, es necesario además aplicar un análisis estadístico que tenga en cuenta la naturaleza multivariada de esas interacciones (Kenkel & Booth 1992). Entre los estudios de la filósfera que analizan las comunidades fúngicas con métodos multivariados, se encuentran el de Cabral & Collantes (1992) en Eucaliptus viminalis Labill. y el de Sieber- Canavesi & Sieber (1993) en Abies alba Mill.

Se plantea como hipótesis que las poblaciones fúngicas que colonizan la filósfera varían según la estación climática y el estadio ontogénico de las acículas y que en períodos estivales hay una mayor disponibilidad de sustrato.

El objetivo de este trabajo es analizar la variación de la comunidad fúngica de la filósfera en función de las estaciones del año utilizando análisis de componentes
principales y análisis discriminante.

MATERIALES Y METODOS

a) Características del sitio de muestreo:

Las muestras se tomaron de una plantación de P. taeda de 14 años de edad, en la Estación Experimental INTA-Delta de la
Provincia de Buenos Aires, Argentina (34º 09' S y 58º 57' O).

El clima de la región es subtropical marítimo, con inviernos con pocas heladas y lluvias todo el año (Papadakis 1980). La temperatura media anual es de 16.1ºC y las lluvias alcanzan un promedio de 999.5 mm de precipitación anual. La variación de la temperatura media mensual, de la humedad relativa y de las precipitaciones en los meses de muestreo han sido citados por Venedikian & Godeas (1996). Los valores de temperatura mínima media más extremos se dan en los meses de junio a agosto y los meses con más horas con temperaturas inferiores a 7°C van de mayo a septiembre (otoño e invierno).

b) Muestreo:

El crecimiento de las ramas de Pinus taeda se realiza con alternancia de períodos anuales de alargamiento y de reposo. Estos se visualizan por las cicatrices que dejan al caer las catáfilas que protegen la yema apical delimitando en el tallo sectores con acículas en distintos estados de madurez. Se tomaron muestras de acículas jóvenes (de hasta 1 año de edad), maduras (1 a 2 años) y senescentes (más de 2 años) en las cuatro estaciones del año: otoño (mayo), invierno (agosto), primavera (noviembre) y verano (marzo).

c) Análisis de las poblaciones fúngicas

I Métodos de aislamiento: Las muestras fueron lavadas en el aparato usado por Parkinson & Williams (1961); Williams et al. (1965), que permite el aislamiento de las especies fúngicas que se encuentran en estado vegetativo. Para ello, i) Se tomaron en cada estación al azar 20 acículas de cada uno de los estadios, cortando 2 cm de la porción central, ii) se lavaron 15 veces de acuerdo con la curva de lavado realizada y se traspasaron a papel de filtro estéril para eliminar el exceso de agua, iii) se eliminaron los extremos, iv) se cortaron dos trozos de 4mm² del segmento restante y se sembraron 4 trozos por caja en agar extracto de malta al 2% más antibióticos (0.5 g estreptomicina y 0.25 g clorhidrato de tetraciclina en 100 mL de agua destilada). Se sembraron 40 trozos de acículas de cada estadio por estación, v) Las cajas se incubaron a 20-25 ºC durante 7 días, aislando las cepas. Estas últimas se sembraron en diferentes medios como agar- avena, czapek (dox) agar, agar papa glucosado, agar papa sacarosa (Hawksworth et al. 1983) y agar extracto de malta (Blakeslee 1915). También se intentó inducir la fructificación con luz UV cercana según Leach (1971). Para la identificación taxonómica se consultó entre otros a: Batista Chaves & Ciferri (1963), Booth (1971), Domsch et al. (1980), Ellis (1971, 1976), Gams (1971), Hermanides- Nijhof (1977), Hughes (1967). Hughes & Sugiyama (1972), Punithalingam (1981), Raper & Fennell (1965), Steyaert (1961) y Sutton (1980).

Con la sigla IND se denominaron los aislamientos fértiles, pero que no pudieron ser identificados, como MDE y MME se
designó a los micelios estériles dematiáceos y moniliáceos, respectivamente.

II Determinación de la frecuencia de cada especie fúngica: Para cada una de las especies aisladas se calculó la frecuencia relativa de acuerdo con la siguiente fórmula

nº veces que aparece una especie F= _____________________________ X 100 nº trozos de hojas

III Análisis multivariado: Para describir la variación de frecuencias fúngicas en la comunidad en relación a las estaciones del
año se utilizaron métodos de ordenamiento multivariados. Estos métodos resumen las tendencias principales en la variación de
los datos (Kenkel & Booth 1992).

Se construyó una matriz básica de datos compuesta por 29 variables y 120 casos. Tomándose como variables las especies fúngicas aisladas y como casos los estados ontogénicos de las acículas y las estaciones del año. Se excluyeron las especies con frecuencias menores al 5%. Para normalizar los datos se utilizó la función x=log(x+0.5)

Se aplicó, para cada estadio ontogénico de las acículas por separado, un método de ordenación, el análisis de componentes principales, (ACP - 4M BMDP, Dixon 1992) que permite expresar los datos en un espacio de 2-3 dimensiones. Los agrupamientos derivados del ACP fueron corroborados mediante análisis discriminante, (AD - 7M BMDP, Dixon 1992).

RESULTADOS Y DISCUSION

En la Tabla I figuran las especies fúngicas aisladas por el método de lavado, con la frecuencia correspondiente a cada una de
ellas, en cada estadio ontogénico de las acículas y cada estación. La mayoría de las cepas fértiles fueron identificadas
taxonómicamente hasta especie. Los micelios IND, MDE y MME tienen en su mayoría fecuencias menores al 5%.

Tabla I: Frecuencia estacional de los taxa fúngicos de la filósfera de Pinus taeda para diferentes estadios ontogénicos de las acículas. IND: indeterminados; MME: micelio moniliáceo estéril; MDE: micelio dematiáceo estéril; J: joven; M: madura; S: senescente.

Las comunidades de las acículas presentan un gran número de especies que aparecen con frecuencias bajas y un pequeño
número con frecuencias altas.

De las 49 especies aisladas, Pestalotiopsis oxyanthi, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, C. xysporum,
C. sphaerospermum, Nigrospora oryzae, Epicoccum purpurascens, Hormonema dematioides y las levaduras pueden
considerarse de importancia en la filósfera de P. taeda por presentar frecuencias mayores en todas o en algunas estaciones y/o
estadios ontogénicos de las acículas. Les siguen en importancia, con frecuencias menores, Xylohypha curta, Penicillium sp.,
Fusarium lateritium, Wardomyces inflatus, Acremonium strictum, MME5 y MDE1.

La composición florística de P. taeda es similar a la citada por Watson et al. (1974); Mishra & Das (1981); Kahlki et al.
(1986); Legault et al. (1989 a, b) para ésta y otras especies del género Pinus.

P. oxyanthi tiene frecuencias mayores en los meses invernales; resultados similares obtiene Pandey (1990) para Pestalotia
Psidii Pat. Por otra parte E. purpurascens no se lo aisló en invierno de ninguno de los estadios de las acículas. H. dematioides, que presenta frecuencias altas en las acículas jóvenes en primavera y verano, también fue citada por Legault et al. (1989 a) para Pinus banksiana Lamb. y P. resinosa Ait. y por Sieber- Canavesi & Sieber (1993) en Abies alba Mill.. Cladosporium cladosporioides predomina en otoño; Collins & Hayes (1976) y Gourbière (1975) obtuvieron resultados similares en Picea abies Karst. y en Abies alba respectivamente.

Venedikian & Godeas (1996) analizan las poblaciones fúngicas de la filosfera de P. taeda y establecen una secuencia de colonización.

En acículas jóvenes

Los primeros cuatro componentes derivados del análisis de componentes principales (ACP) efectuado sobre la matriz de frecuencias fúngicas (18 taxa x 40 muestras) explicaron el 43.10 % de la variación entre las muestras. La combinación de los componentes C1, C3 y C4, son los que explican más claramente los cambios estacionales de la comunidad fúngica de las acículas jóvenes (Figs. 1 y 2).

Fig. 2: Análisis de componentes principales. Distribución de las muestras en el espacio de los componentes C1 y C4 para acículas jóvenes de P. taeda.

Sobre el extremo positivo del componente C1 se encuentran las muestras correspondientes a otoño-invierno caracterizadas por la presencia de Pestalotiopsis oxyanthi, una especie fúngica característica de este período. En el extremo negativo se encuentran las muestras de primavera-verano caracterizadas por la presencia de Hormonema dematioides y las levaduras. Este componente estaría asociado con los valores de temperatura mínima media, cuyos valores más altos se registran en el período primavera-verano, y/o las horas mensuales con temperaturas menores o iguales a 7°C. Los componentes C3 y C4 permiten la segregación de las estaciones que componen los dos períodos. El C3 permite la segregación de las muestras de primavera y de verano. Las primeras, ubicadas sobre el extremo negativo del componente, están caracterizadas por la presencia de Xylohypha curta, mientras que las segundas (extremo positivo) se caracterizan por la presencia de Chaetomium globosum y Alternaria alternata. El C4 permite la segregación de las muestras de otoño e invierno; las primeras se caracterizan por la presencia de Fusarium lateritium y F. sulphureum, mientras que en las segundas dichas especies son poco frecuentes o están ausentes.

Las variaciones estacionales en la comunidad fúngica, detectado por ACP, fueron confirmadas mediante análisis discriminante
(AD), utilizando como variable de agrupamiento la estación. La clasificación general obtenida de dicho análisis indica que el
85% de las muestras fueron clasificadas correctamente (Wilks' lambda= 0.009; P< 0.001). Las dos primeras funciones
discriminantes extraídas del AD explicaron el 98.68 % de la varianza total. La posición de las muestras en relación a ambas
funciones indica que el período otoño-invierno está asociado a valores positivos de la función 1, mientras que el período
primavera-verano a valores negativos. La función 2 segrega las distintas estaciones que componen los 2 períodos (Fig. 3).

Fig. 3: Análisis de la función discriminante de los datos de frecuencias de acículas jóvenes de P. taeda. en el espacio de las variables canónicas (VC1- VC2).

La yema apical de Pinus taeda retoma el crecimiento en agosto, dando primordios foliares que en el censo de primavera ya
son acículas jóvenes. Hacia fin del invierno posiblemente tenga lugar un proceso de inmigración (Kinkel 1992) de propágulos
de diversos hongos y principalmente de H. dematioides y varias especies de levaduras hialinas provenientes del aire (por
emigración a partir de acículas maduras y senescentes) que llegan hasta las acículas jóvenes colonizándolas y caracterizando así las comunidades fúngicas en primavera y verano.

Estas especies han sido definidas por Dickinson (1976) como habitantes del filoplano y se las considera ruderales (r-selection)
por colonizar un sustrato nuevo. Hacia fines del verano la acícula joven recibe inmigración de propágulos de P. oxyanthi del
aire, siendo la acícula madura la fuente de este inóculo, ya que está intensamente colonizada por esta especie (Tabla I). P.
oxyanthi coloniza así la acícula joven y caracteriza las comunidades fúngicas de otoño e invierno, creciendo en forma endofítica (Steyaert, 1953); lo que le permitiría la supervivencia a temperaturas bajas, parámetro con el que estaría asociado el componente 1, (Fig. 1 y Fig. 2).

El componente 3 segrega los censos de verano (caracterizados por A. alternata y Chaetomium globosum), de los censos de primavera (caracterizados por Xylohypha curta y las levaduras). Este factor podría estar relacionado con las precipitaciones, mayores en primavera con respecto al verano (Venedikian & Godeas 1996). Las levaduras caracterizan a las comunidades fúngicas de las acículas jóvenes en primavera; estos microorganismos son higrófilos durante todo su ciclo de vida (Hoog &
McGinnis 1987). Como en Eucaliptus viminalis (Cabral & Collantes 1992) en las acículas jóvenes de P. taeda se pueden ver claramente las diferencias estacionales en las comunidades fúngicas.

En acículas maduras

Los componentes extraídos del análisis de componentes principales (ACP) efectuado sobre la matriz de frecuencias fúngicas
(23 taxa x 40 muestras) no permitieron identificar los cambios estacionales en la comunidad de las acículas maduras. De todas
formas se intentó examinar la estacionalidad mediante AD, utilizando la estación como variable de agrupamiento. Sólo el 45%
de muestras fueron correctamente clasificadas por el AD (Wilks'lambda=0.67, NS); el 100 % de las muestras de otoño e
invierno fueron clasificadas incorrectamente.

En primavera las acículas maduras tienen un año de edad y P. oxyanthi completa la colonización que inició en las acículas
jóvenes (otoño- invierno). Por su parte H. dematioides ya presente en acículas jóvenes puede sobrevivir a las condiciones invernales por poseer hifas de paredes gruesas o colonizar endofíticamente la acícula como en Abies alba (Sieber-Canavesi & Sieber 1993). Al darse las condiciones de temperatura apropiadas proliferan en las acículas maduras en primavera.

En verano las acículas maduras están colonizadas por Cladosporium sphaerospermum, habitante del filoplano y por A.
alternata, un invasor del filoplano (Dickinson 1976).

En las acículas maduras se encontró la mayor diversidad específica (Venedikian & Godeas 1996), como consecuencia de una
mayor exposición temporal a los procesos de inmigración y de un sustrato con características nutricionales que permitió el
establecimiento de diversas especies. El sustrato se satura de especies (K-selection); a medida que avanza la colonización de la
acícula algunas especies del filoplano pueden colonizar internamente los tejidos; ésto sumado a la gran diversidad específica
determinaría que las variaciones estacionales no se vean reflejadas en las comunidades fúngicas.

En acículas senescentes

Los primeros cuatro componentes derivados del análisis de componentes principales (ACP) efectuado sobre la matriz de
frecuencias fúngicas (15 taxa x 40 muestras) explicaron el 57.54 % de la variación entre las muestras. Los cambios
estacionales en la comunidad fúngica de las acículas senescentes son claramentes explicados por la combinación de los
componentes C2 y C3 (Fig. 4).

Fig. 4: Análisis de componentes principales. Distribución de las muestras en el espacio de los componentes C2 y C3 para acículas senescentes de P. taeda.

Sobre el extremo positivo del componente C2 se encuentran las muestras correspondientes a primavera caracterizadas por la
presencia de Cladosporium cladosporioides (habitante del filoplano), Nigrospora oryzae y Epicoccum purpurascens
(ambas invasoras del filoplano); en el extremo negativo se encuentran las muestras de invierno caracterizadas por la presencia
de Pestalotiopsis oxyanthi. El componente C3 permite la segregación de las muestras de verano y otoño. Las primeras están
caracterizadas por la presencia de levaduras y MDE1, mientras que en las segundas, dichos taxa están ausentes o son muy
poco frecuentes.

Las variaciones estacionales en la comunidad fúngica detectado por ACP fue confirmada mediante análisis discriminante (AD), utilizando como variable de agrupamiento la estación. La clasificación general obtenida de dicho análisis, indica que el 85% de las muestras fueron clasificadas correctamente (Wilks'lambda=0.049, P< 0.001). Las dos primeras funciones discriminantes extraídas del AD explicaron el 89 % de la varianza total. La posición de las muestras en relación a ambas funciones indica que el verano está asociado a valores negativos de la función 1. El resto de las estaciones son segregadas por la función 2; las muestras otoñales están asociadas con los valores positivos de la función, las invernales a valores negativos y las primaverales a valores intermedios (Fig. 5).

Fig. 5: Análisis de la función discriminante de los datos de frecuencias de acículas senescentes de P. taeda en el espacio de las variables canónicas (VC1- VC2).

En este estadio de madurez así como en las acículas juveniles, la estacionalidad es marcada coincidiendo ésto con la menor
variabilidad específica. Esto último puede atribuirse a una menor disponibilidad de nutrientes o a la lixiviación más intensa en la
senescencia, de sustancias antimicrobianas (polifenoles en coníferas) que impiden el desarrollo de algunas especies fúngicas
(Millar 1974; Blakeman & Atkinson 1981)

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Fecha de publicación: 30 de mayo de 2002

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Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 1428 Buenos Aires, Argentina.