INTRODUCCIÓN

El microbioma vegetal incluye las diversas comunidades que se encuentran asociadas con las plantas, incluyendo aquellas que residen dentro de sus tejidos (^{Santoyo et al., 2016}). Las bacterias endófitas pueden habitar dentro de los tejidos vegetales sin provocar ningún daño, ya sean raíces, tallos, hojas, flores o semillas (^{Hallman et al., 1997}). Diversos trabajos han demostrado que las bacterias endófitas son capaces de interactuar de una manera muy eficiente con sus hospederos, comparado con aquellas que habitan la filósfera o rizósfera (^{Ali et al., 2014}). De hecho, se ha propuesto a la rizósfera -uno de los ecosistemas más diversos- como una fuente de adquisición de endófitos para las plantas, ya que las grietas de las raíces, así como las diversas heridas de tejidos que ocurren como resultado del crecimiento de la planta, entre otros daños mecánicos, permiten a las bacterias rizosféricas penetrar y colonizar los tejidos internos (^{Sorensen y Sessitsch, 2007}). En un trabajo de Márquez-Santacruz et al. (2010) reportaron que existe una mayor diversidad de filotipos en la rizósfera de plantas de tomate verde (Physalis ixocarpa) comparado con la diversidad de endófitos bacterianos. Sin embargo, la gran mayoría de los filotipos de endófitos bacterianos fueron detectados en el ambiente rizosférico, corroborando que dicho microecosistema es una fuente potencial de bacterias endófitas.

Numerosos estudios han documentado los efectos benéficos de las bacterias endófitas, tales como promoción del crecimiento y protección vegetal contra la infección de fitopatógenos (^{Becerra-Castro et al., 2011}; ^{Zgadzaj et al., 2015}; ^{Contreras et al., 2016}) Además, se ha demostrado que los endófitos bacterianos son capaces de inducir vías de resistencia en plantas, aumentando las capacidades de sobrevivir a diversos tipos de estrés ambiental, como el abiótico, salino, entre otros (^{Sziderics et al., 2007}, ^{Doty et al., 2009}, ^{Ali et al., 2014}) . Los mecanismos benéficos que llevan a cabo las especies endófitas durante la interacción con plantas se han catalogado como directos e indirectos (^{Glick, 2014}). Los mecanismos directos de promoción del crecimiento vegetal incluyen la producción de proteasas, sideróforos, fitohormonas como el ácido indolacético (AIA), y compuestos como el cianuro de hidrógeno (HCN), entre otros (Glick, 2014; Santoyo et al., 2018). Por otra parte, los mecanismos indirectos incluyen las acciones inhibitorias, antagónicas o de control biológico de potenciales fitopatógenos. Sin embargo, la producción de algunos compuestos podría traslaparse entre mecanismos directos e indirectos, pudiendo jugar un papel importante durante el biocontrol de patógenos y al mismo tiempo, mejorar la nutrición de la planta. Por ejemplo, la producción de sideróforos, la actividad ACC desaminasa o la producción de HCN (Glick, 2014). De forma interesante, el HCN tiene funciones como elicitor de la respuesta sistémica inducida, así como promotor del crecimiento y de antagonista contra hongos fitopatógenos (^{Huang et al., 2012}; ^{Meldau et al., 2013}).

Un paso importante para conocer las actividades benéficas de las bacterias endófitas de las plantas es conocer su diversidad, y hasta ahora, cada planta que se ha analizado en diversas partes del mundo ha demostrado que contienen microorganismos endófitos, siendo las clases a, p y y-Proteobacteria de las más comúnmente reportadas, seguido de las clases Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Planctomycetes y Verrucomicrobia. Cabe destacar que la diversidad y densidad de endófitos depende de diversos factores abióticos (i.e. la localización geográfica) y bióticos (i.e. la especie vegetal hospedera), y que son pocos los trabajos que han reportado dichos análisis (Pérez-Cordero et al., 2010). En cuanto a los géneros detectados como endófitos, Bacillus, Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Micrococcus, Pantoea y Microbacterium están entre los más abundantes y comúnmente reportados (^{Hallmann et al., 1997}; Márquez-Santacruz et al., 2010; Friesen et al., 2011). Así mismo, dentro de los géneros antes mencionados, son varios los que exhiben mecanismos directos e indirectos de promoción del crecimiento vegetal (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006).

El Estado de Michoacán, en México, es uno de los principales productores de frutillas o "berries" en el país, incluyendo zarzamora, fresa, frambuesa y arándano. De la producción total de frutillas en México, el 80% se exporta a otras regiones del mundo (www.sagarpa.gob.mx). Dado que existen diversas regulaciones internacionales para importar/exportar productos sin agroquímicos, es necesario implementar estrategias, como el desarrollo de bioinoculantes que promuevan el crecimiento vegetal y combatan las plagas en los cultivos, y que no contaminen el ambiente, ni sean un riesgo para la salud humana.

Consistente con lo anterior, en este trabajo se aisló y se caracterizó por medio de la secuenciación de los genes 16S rDNA la diversidad de comunidades bacterianas endófitas de plantas de arándano de cultivos ubicados en el Estado de Michoacán, México. Así mismo, se determinó el grupo de especies endófitas con la capacidad potencial para promover el desarrollo vegetal.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras vegetales

Se aislaron las bacterias endófitas de un total de 12 plantas de arándano (Vaccinium corymbosum L.) cv. Biloxi. Las plantas de dos meses de edad, en fase de crecimiento vegetativo y sin síntomas de daños por fitopatógenos, fueron colectadas de invernaderos localizados en Uruapan (19°25'16" N, 102°03'47" O), Michoacán, México.

Aislamiento de bacterias endófitas

Los tejidos de raíz, tallo y hojas se separaron para ser analizados de forma independiente, los cuales se lavaron con agua destilada estéril. En caso de las raíces se retiraron cuidadosamente las partículas adheridas de suelo. Posteriormente, se obtuvieron 1 g de tejido de cada órgano de cada planta y se esterilizaron superficialmente como se ha reportado previamente para aislar los endófitos bacterianos (^{Contreras et al., 2016}). En breve, las raíces se sumergieron en etanol al 70% durante 30 segundos, se lavaron con solución de hipoclorito de sodio fresco (2,5% de Cl^-) durante 5 min, se lavaron con etanol al 70% durante 30 seg y finalmente se lavaron de cinco a diez veces con agua destilada estéril. Para confirmar aún más que el proceso de esterilización fue bueno, alícuotas del agua destilada estéril usada en el enjuague final se esparcieron en cajas Petri con medio agar nutritivo. Las placas se examinaron para el crecimiento bacteriano después de la incubación a 28°C durante 4 días, sin observar crecimiento bacteriano. Se realizaron tres réplicas independientes de diluciones seriadas por gramo de tejido fresco de hoja, tallo y raíz, previamente macerado en morteros estériles, para obtener la densidad bacteriana cultivable. Para lo cual, se tomaron 100 |jL de cada dilución para ser dispersados en cajas de Petri conteniendo agar nutritivo al 20%, las cuales se incubaron por 72 horas a 30°C, realizando conteos de las unidades formadoras de colonias (UFC) al final de dicho periodo por gramos de peso fresco de cada tejido analizado.

Caracterización molecular de aislados endófitos

Se aisló el ADN genómico de 92 cepas bacterianas seleccionadas al azar. Se utilizaron los oligonucleótidos bacterianos fD1 y rD1 (^{Weisburg et al., 1991}) para amplificar y secuenciar el gen ribosomal 16S. Las condiciones de PCR se han informado previamente (Márquez-Santacruz et al., 2010). Todos los productos de PCR se purificaron y secuenciaron en Mr. DNA (Texas, U.S.). Las secuencias de 16S rADN obtenidas se sometieron a búsquedas de tipo Blast contra las bases de datos del GenBank (NCBI).

Análisis filogenético

Se generaron múltiples alineamientos de secuencias de ADN y se realizó el análisis filogenético de las secuencias del gen 16S rDNA con el programa MEGA 5.0 (^{Tamura et al., 2011}). Todas las secuencias pasaron controles de calidad y con el fin de obtener un valor de confianza para el conjunto de datos de secuencias alineadas, se realizó un análisis de bootstrap de 1000 repeticiones. Un árbol filogenético se construyó mediante el algoritmo de máxima verosimilitud. Otros métodos mostraron topologías similares.

Identificación de actividades promotoras del crecimiento vegetal

Se usaron placas de agar de Skim Milk (SM) para detectar la producción y actividad de proteasas (^{Kumar et al., 2005}). La producción de sideróforos se determinó mediante el ensayo de cromo azurol S (CAS) (^{Schwyn y Neilands, 1987}). Los experimentos se realizaron por triplicado y en ambos casos para la actividad proteolítica y producción de sideróforos se determinó midiendo el halo formado por cada aislado en el determinado medio de cultivo. La producción de ácido indol-3-acético (IAA) se analizó como se publicó previamente en ^{Hernández-León et al. (2015}). Se usó GC-MS (Gas Chromatograph 6850 Series II - Detector de Espectrometría de Masas 5973, Agilent, Foster City, California, USA) para su análisis. La identidad del AIA se confirmó mediante la comparación del tiempo de retención en los extractos bacterianos con muestras del estándar de IAA (Sigma-Aldrich). Las cantidades de AIA producidas por los aislados bacterianos se estimaron utilizando curvas de calibración. La capacidad de formación de biofilm en las bacterias se analizó siguiendo el protocolo de Wei y Zhang (1996), donde se emplea cristal violeta al 0,1% para teñir las células adheridas a tubos Eppendorf y se mide la D.O. en un espectrofotómetro una longitud de onda a 570 nm.. Los experimentos se realizaron por triplicado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Población y diversidad bacteriana, y su relación filogenética

Los endófitos bacterianos fueron aislados de los diferentes tejidos de plantas de arándano, obteniendo las siguientes unidades formadoras de colonia por gramos de peso freso (UFC g^-1); en raíces fue de 1,0 x 10⁵ ± 0,8x10⁵, mientras que en hojas encontramos una densidad de 5,5 x 10⁴ ± 0,5 x 10⁴, y para tallo fue de 2,0 x 10⁴ ± 0,2 x 10⁴, siendo este último el tejido con menor población de bacterias endófitas (Fig. 1).

Para tener una representación de la diversidad bacteriana cultivable en plantas de V. corymbosum L. cv. Biloxi se seleccionaron aleatoriamente aislados axénicos para la secuenciación del gen ribosomal 16S. Así, mediante búsquedas de homología tipo Blast, se detectaron 24 especies bacterianas diferentes u OTUs (Unidades Taxonómicas Operacionales). Los OTUs encontrados pertenecen a 4 Filos, incluyendo Bacteroidetes (1,1%), Actinobacterias (23,9), Firmicutes (12,5%) y Proteobacterias, las cuales fueron las más abundantes (62,5%). Con respecto a las especies, encontramos que 16 aislados pertenecen a Pantoea agglomerans (17,4%), Pseudomonas protegens (10,8%), Streptomyces griseocarneus (9,7%) y Burkholderia contaminans (8,7%). Otras especies menos abundantes fueron Azoarcus evansii, Bacillus cereus, Microbacterium terrae, Sphingopyxis taejonensis, entre otros (Fig. 2).

El gen ribosomal 16S analizado en los 92 aislados endófitos asociados de los diferentes tejidos de V. corymbosum L. cv. Biloxi muestran estrechas relaciones con la mayoría de especies bacterianas identificadas en el GenBank, con identidades y coberturas mayores al 97%, representando los 4 Filos encontrados: Bacteroidetes, Actinobacterias, Firmicutes y Proteobacterias (Fig. 3). Dentro de nuestro análisis y búsqueda de homologías, los aislados denominados PEV59, PEV70, PEV72 y PEV75, no presentaron identidad con genes ribosomales mayor al 97%. Lo anterior necesita una caracterización molecular más exhaustiva para asignar a que especie pertenecen (Tabla suplementaria).

Se ha propuesto que los microbiomas o microorganismos asociados a las plantas constituyen un segundo genoma vegetal (^{Turner et al., 2013}). Las interacciones entre el microbioma y las plantas pueden ser diversas; sin embargo, aquellas benéficas como la promoción del crecimiento vegetal y biocontrol de fitopatógenos son importantes para su uso agro-biotecnológico (entre otras muchas aplicaciones). En este trabajo, se destaca que el grupo dominante es el filo Proteobacterias, y Clase Gammaproteobacteria, lo cual es consistente con otros estudios (Márquez-Santacruz et al., 2010). Los géneros bacterianos Pantoea, Pseudomonas, Streptomyces, Burkholderia y Bacillus fueron encontrados en este análisis como endófitos de las plantas de arándano. En el caso de Pantoea, ha sido reportado como endófito residente de diferentes plantas, como el arroz y vid (uva) (^{Elvira-Recuenco y van Vuurde, 2000}; ^{Andreolli et al., 2016}). Una cepa (TR-5) de Pantoea ananatis aislada de granos de maíz inhibió in vitro el crecimiento del hongo Lecanicillium aphanocladii (^{Zinniel et al., 2002}).

Los géneros Pseudomonas y Burkholderia han sido ampliamente estudiados por la producción y emisión de su diversa gama de productos metabólicos secundarios incluyendo antibióticos, como las fenazinas, el 2,4-diacetilfloroglucinol, compuestos orgánicos volátiles antifúngicos como el ácido cianhídrico, la dimetilhexadecilamina o el dimetildisulfuro (^{Hernández-León et al., 2015}). Las especies como Bacillus thuringiensis producen proteínas Cry con actividad insecticidas, mientras que otros compuestos como los sideróforos también pueden inhibir el crecimiento de micelio a través de la captación de hierro, haciéndolo menos disponible para los patógenos (^{Martínez-Absalón et al., 2014}). Las especies pertenecientes al género de Stenotrophomonas han sido aisladas o detectadas como endófitas de raíces de arroz (^{Sun et al., 2008}), raíces y tallos de algodón (^{McInroy y Kloepper, 1995}). Algunos estudios proponen a Stenotrophomonas como bacterias promotoras del crecimiento de las plantas, y que podrían suprimir el desarrollo de la enfermedad por secreción de algunos compuestos, como el antibiótico maltofilina (Jakovi et al., 1996).

Otro grupo de bacterias en plantas de arándano lo constituyen endófitas del género Microbacterium, el cual se ha reportado en asociación endofítica con diferentes plantas (^{Conn y Franco, 2004}; ^{Santoyo et al., 2016}). De hecho, Conn y Franco (2004) reportaron varias especies de Microbacterium en un análisis de las poblaciones endofíticas en las raíces de trigo (Triticum aestivum L.), siendo el género predominante dentro de la comunidad bacteriana endófitica. Lo anterior, junto con otros reportes, muestran que las bacterias endófitas se encuentran asociadas a gran parte de las plantas de interés comercial que se han estudiado i.e. arroz (Oryza sativa), banano (Musa acuminata), trigo (Triticum aestivum), zarzamora (Rubus fruticosus), caña de azúcar (Saccharum spp.), zanahoria (Daucus carota), maíz (Zea mays), papa (Ipomoea batatas), uva (Vitis vinifera), entre otros (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006; ^{Andreolli et al., 2016}; ^{Contreras et al., 2016}).

Caracterización de mecanismos de promoción del crecimiento vegetal

Adicional a determinar la diversidad endófita bacteriana de V. corymbosum L. cv. Biloxi, y con el fin de explorar el potencial papel funcional de los aislados en los tejidos internos de la planta, se exploraron algunas actividades de promoción del crecimiento de plantas. En general, se encontró que aproximadamente el 42% de los aislados endófitos mostraron al menos una actividad benéfica (Fig. 4). Algunos aislados como Bacillus toyonensis PEV85 y Pantoea ananatis PEV86, mostraron una mayor producción de ácido indolacético, de 32 y 20 µg mL^-1, respectivamente, comparado con la rizobacteria promotora del crecimiento vegetal Pseudomonas fluorescens UM270 (^{Hernández-León et al., 2015}), que produce un promedio de 10 µg mL^-1 (Fig. 4A). La Fig. 4, panel B, también muestra el análisis de algunos aislados endófitos como Pantoea agglomerans PEV20, PEV23, PEV27, Streptomyces griseocarneus PEV8, PEV11 y Bacillus cereus PEV17, los cuales tienen, en general, una significativa producción de biofilm a las 24, 48 y 72 horas, similar a la cepa UM270. Otros aislados no mostraron producción de biofilm o no fue significativa. Respecto a la producción de sideróforos, destacan cepas endófitas de Pseudomonas protegens, las cuales presentan un diámetro del halo de producción de sideróforos similar a UM270 en el medio CAS (Fig. 4C).

En el panel D de la Fig. 4 también se muestra la actividad proteolítica de algunos aislados, los cuales mostraron un halo de degradación mayor comparado con la cepa UM270. Estos resultados muestran el posible papel benéfico que juegan los endófitos bacterianos en plantas de arándano.

Además de analizar la población y diversidad genética de bacterias endófitas cultivables de plantas de arándano, se buscaron actividades relacionadas con la promoción del crecimiento vegetal, incluyendo la producción de fitohormonas (ácido indolacético), producción de biofilm, sideróforos y preoteasas. Así, con el objetivo de identificar potenciales microorganismos promotores del crecimiento vegetal endófitos de cultivo de arándano, se compararon las capacidades de las bacterias endófitas con la cepa UM270 de Pseudomonas fluoresnces, la cual es una bacteria rizosférica con diversos mecanismos directos e indirectos de promoción del crecimiento vegetal ya reportados, además de presentar características de competencia y de colonización de la rizósfera de maíz (^{Hernández-León et al., 2015}; ^{Rojas-Solís et al., 2016}). En este trabajo se encontró diferentes aislados con capacidades comparables o mayores que la cepa UM270. Por ejemplo, Bacillus toyonensis PEV85 y Pantoea ananatis PEV86 mostraron una mayor producción de ácido indolacético. Pantoea agglomerans PEV20, PEV23, PEV27, Streptomyces griseocarneus PEV8, PEV11 y Bacillus cereus PEV17 presentaron una buena producción de biofilm a diferentes tiempos, mientras que respecto a la producción de sideróforos, destacan cepas endófitas de Pseudomonas protegens. El aislado Burkholderia contaminans mostró una alta actividad proteolítica; sin embargo, es necesario analizar si dicha capacidad no tiene algún papel fitotóxico.

La producción de fitohormonas, como el AIA es una de las principales actividades que promueven el crecimiento y desarrollo de las plantas, ampliamente reportada en diversas especies bacterianas asociadas a plantas (^{Noh Medina et al., 2014}; ^{Hernández-León et al., 2015}). Por otra parte, las bacterias interactúan físicamente con las superficies a través de la formación de biofilm o un conjunto complejo multicelular, que puede incluir a menudo múltiples especies. ^{Danhorn y Fuqua (2007}) proponen que existe una creciente apreciación de que la intensidad, la duración y el resultado de las interacciones entre las plantas y los microorganismos están significativamente influenciados por la conformación de las poblaciones microbianas adherentes. La capacidad de adhesión o "attachment" es necesaria para la formación de biofilm, lo cual permite que las bacterias interactúen con los tejidos vegetales, a través de adhesinas incluyendo polisacáridos y proteínas de superficie. Las bacterias rizosféricas con buena formación de biofilm, por lo tanto, son consideradas buenas colonizadoras de la rizósfera, capaces de adherirse la superficie de raíces y poder formar nódulos o penetrar los tejidos para convertirse en endófitas (^{Santoyo et al., 2016}).

Los sideróforos microbianos son compuestos quelantes de hierro. Así, el hierro del suelo o de un ambiente endófito es captado por los sideróforos, los cuales actúan como sistemas de transporte del elemento hacia las bacterias y dentro de la planta, además de hacerlo menos disponible para los patógenos (^{Silver y Walderhaug, 1992}). Se ha demostrado que mediante este mecanismo los sideróforos restringen el crecimiento de microorganismos que causan enfermedades en plantas (^{Weller, et al., 2002}). Con respecto a la producción de enzimas líticas, se ha observado que cepas endófitas de maíz pertenecientes al género Bacillus, pueden inhibir hongos patógenos como Fusarium verticillioides, Colletotrichum graminicola, Bipolaris maydis y Cercospora zea-maydis (Szilagyi-Zecchin et al., 2014). ^{Granér y colaboradores (2003}) también observaron que bacterias endófitas aisladas de diferentes cultivares de Brassica napus con la capacidad de producir proteasas y celulasas, mostraron actividad antifúngica contra el patógeno de marchitez Verticillium longisporum.

CONCLUSIÓN

Las bacterias cultivables endófitas de arándano (Vaccinium corymbosum L.) cv. Biloxi muestran diversos mecanismos de promoción del crecimiento vegetal, ya sea directos e indirectos, siendo candidatos promisorios para su estudio y aplicación como inoculantes (biopromotores y biofungicidas) para el cultivo de arándano.