INTRODUCCION

El género Capsicum ha sido ampliamente es tudiado debido a que sus frutos son una fuente rica en capsaicinoides y además cuando el fruto está maduro su pericarpio contiene altas con centraciones de carotenoides. Cuando el fruto está inmaduro el color de su pericarpio es verde y tiene alta concentración de clorofila; a medida que madura, la concentración de los carotenoides aumenta y el contenido de clorofila baja (^{Ignat et al., 2013}; ^{Gómez-García y Ochoa-Alejo, 2013}). Los carotenoides en las plantas ayudan a la clorofila para el aprovechamiento de la luz y actúan como protectores de la foto-oxidación. Los animales y humanos no pueden sintetizarlos, pero sí pueden obtenerlos de la ingesta de vegetales y frutas, por lo que el consumo de estos frutos es recomenda ble para aprovechar sus beneficios, tales como propiedades antioxidantes, fuente de vitamina A y prevención de enfermedades como el cán cer (^{Kim et al., 2009}). Por estas razones el género Capsicum tiene mucha demanda en la industria de alimentos, medicinas, pinturas, entre otras.

Diversos estudios se han realizado sobre la concentración de carotenoides en el pericarpio de chiles, principalmente mediante la técnica de cro matografía liquida de alta resolución (^{Sun-Hwa et al., 2007}; ^{Rodriguez-Uribe et al., 2012}; ^{Kilcrease et al., 2013}; ^{Giuffrida et al., 2013}), en los cuales se han estudiado frutos de diversas especies y con distintos colores en su etapa madura. En general, se observa que cuando el fruto es de color amari llo se espera mayor contenido de luteína, cuando es de color naranja se espera capsantina y zeaxan-tina, y para los colores rojos los que dominan son la capsantina y la capsorrubina (^{Gómez-García y Ochoa-Alejo, 2013}).

Por otra parte, la espectroscopía Raman es una herramienta ampliamente utilizada en el es tudio de una gran variedad de materiales, debido a que es una técnica rápida, no-destructiva y que no necesita preparación de la muestra. En la rama de la fitotecnia, la espectroscopía Raman se ha utilizado para el estudio de plantas (^{Withnall et al., 2003}; ^{Baranski et al., 2005}; ^{Schulz et al., 2005}; ^{Baranska et al., 2013}), frutas (^{Prinsloo et al., 2004}; ^{López-Sánchez et al., 2010}; ^{Szymañska-Chargot et al., 2011}; ^{Trebolazabala et al., 2013}) y vegetales (^{Bhosale et al., 2004}; ^{De Nardo et al., 2009}; ^{Killeen et al., 2013}; ^{Qin et al., 2011}), entre otros. En cuan to al género Capsicum, se han reportado diversos estudios con espectroscopía Raman, en donde los espectros son ampliamente influidos por el con tenido de los carotenoides (Withnall et al., 2003; Schulz et al., 2005; ^{De Oliveira et al., 2010}). El es pectro Raman característico del Capsicum es do minado por la presencia de 3 picos característicos muy intensos, originados por los modos vibracio-nales de los enlaces C=C (v₁), C-C (v₂) y C-CH₃ (v₄) de los carotenoides, localizados alrededor de 1517, 1158 y 1004 cm^-1, respectivamente.

En general, es difícil determinar con exactitud el tipo de carotenoide a partir de los tres modos de vibración, ya que se ha reportado que dichos valores pueden ser afectados por tres factores: principalmente la cantidad de enlaces dobles conjugados de carbono-carbono que existen en la cadena principal de los carotenoides (^{Withnall et al., 2003}), del grupo cíclico terminal en la cadena del polieno, y de los compuestos que rodean a los carotenoides (^{Schulz et al., 2005}; ^{Baranska et al., 2013}, ^{De Oliveira et al., 2010}). Sin embargo, es de mucha utilidad para estudiar la relación de con centración de carotenoides con otros constituyen tes, como puede ser la clorofila.

Aunque la técnica de espectroscopía Raman ya se ha utilizado para el estudio de otras espe cies de chiles (Capsicum sp.), existen pocos estu dios enfocados exclusivamente a la especie Capsicum chinense Jacq. Además, no se han reportado estudios en diferentes etapas de maduración. En este trabajo se presenta el estudio Raman del pericarpio de tres variedades de chile habanero, que en su etapa madura presentan color amarillo, naranja o rojo, con la finalidad de identificar la clorofila en su etapa inmadura y los cambios de composición que su pericarpio sufre en el proceso de maduración.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se estudiaron frutos de habanero de tres varie dades de chile: Mayan Kisin, Mayan Ek y Mayan Kiin, las cuales en su etapa madura son de color amarillo, naranja y rojo, respectivamente, cose chados en la región sureste de México, en la zona central del estado de Veracruz; se cultivaron a cie lo abierto, a una altitud aproximada de 500 msnm y a una temperatura promedio de 25°C. Los fru tos inmaduros fueron cortados aproximadamen te a los 70 días de su plantación, y los maduros a los 85. Las mediciones Raman fueron realizadas en un microscopio confocal (Thermo Scientific, modelo DXR, Madison, Estados Unidos) equipa do con un láser de emisión en 532 nm y 10 mW de potencia. Se utilizó un tiempo de colección de 5 s y 30 exposiciones. Se cortaron muestras de 1 cm² y se estudiaron bajo dos configuraciones: Modo A: el láser incide de manera perpendicular a la superficie del habanero, y Modo B: el láser incide de manera paralela a la superficie del habanero. Con esta configuración fue posible estudiar el endocarpio y el mesocarpio, sin la contribución del exocarpio.

RESULTADOS Y DISCUSION

La Fig. 1 muestra los espectros Raman del pericarpio del habanero amarillo (línea negra), naranja (línea gris punteada) y rojo (línea roja), comparados con el espectro Raman de un fruto inmaduro (línea verde). En 1005, 1154 y 1520 cm^-1 se observan los tres picos asociados a los C=C (ν₁), C-C (ν₂) y C-CH3 (ν₄) de los carotenoides, ya comentados previamente. Entre 2000 y 3100 cm-1 se observan 8 picos etiquetados como P1, P2, … P8, algunos de ellos son identificados como los armónicos de los modos fundamentales, es decir son combinaciones lineales de ν₁, ν₂ y ν₄. De acuerdo a los estudios teóricos y experimentales reportados (^{Tommasini et al., 2014}), estos armónicos pueden ser definidos como: P₁ = 2 ν₄, P₂ = ν₄ + ν₄, P₃ = 2ν₁, P₄ = ν₁ + ν₄, P₅ = ν₁+ν₂ y P₈ = 2ν₁. Los picos P6 y P7, localizados alrededor de 2857 y 2908 cm^-1, respectivamente, presentaron intensidades con muy ligera variación entre los espectros del habanero inmaduro y los frutos maduros, lo que significa que estas señales son originadas por algo que no sufre variaciones en el proceso de maduración (no es el caso de la clorofila ni de los carotenoides).

Fig. 1 Espectros Raman de habaneros maduros de color amarillo (A), naranja (N) y rojo (R), comparados con el de un fruto inmaduro verde (V). 

Fig. 2 Comparación de los espectros Raman de un fruto inmaduro (V) y uno maduro (R) de habanero rojo var. Mayan Kisin. La escala vertical de la izquierda es para el espectro del fruto inmaduro y la de la derecha para el fruto maduro.  

La Fig. 2 muestra la comparación de los espec tros Raman del pericarpio de un fruto inmaduro y de uno maduro de color rojo, entre 800 y 1800 cm^-1. Se normalizaron todos los espectros con res pecto al pico P7, considerando que dicha señal no sufre variación, y para una mejor comparación de las señales se utilizó una escala para cada espec tro. En el espectro del fruto inmaduro se observan picos en 1203, 1265, 1440 y 1630 cm^-1, que son asociados a los modos vibracionales originados por la clorofila a (etiquetassombreadas de verde) y tres señales más (etiquetas amarillas) en 1121, 1165 y 1604 cm^-1 asociadas a la bacterio-clorofila a (Lute, 1974; ^{Ceccarelli et al., 2000}; ^{Zheng-Li et al., 2002}). En el espectro del habanero rojo se obser van solo cuatro picos en 1006, 1187, 1155 y 1516 cm^-1 asociados a los carotenoides, principalmente. Considerando el cambio de intensidad entre los espectros de frutos maduros y el del inmaduro, es fácil concluir que la concentración de carotenoides en la etapa inmadura es prácticamente nula, por lo queel espectro Raman es dominado por señales originadas por clorofila a y bacterioclorofila a, y que se maximiza cuando el fruto está en su etapa madura, lo cual tiene congruencia con lo que ^{Ignat et al. (2013}) observaron en sus estudios de pimiento morrón (Capsicum annuum) con la técnica de espectrometría infrarroja de onda cor ta. La Fig. 3 muestra el estudio Raman realizado a un fruto inmaduro de la variedad Mayan Kiin, el cual en su etapa madura era de color amarillo, durante un periodo de 12 días después de ha berse cosechado. Se observó que aun cuando el fruto fue cosechado en su etapa inmadura (color verde), la concentración de carotenoides va incre mentándose, y después de los 12 días su cambio de coloración fue más evidente, justo cuando el espectro Raman es dominado por las señales ori ginadas por los carotenoides. Lo anterior deja cla ro que mediante la espectroscopía Raman, es po sible monitorear la concentración de carotenoides del chile habanero durante su proceso de madu ración. Considerando que existen en el mercado muchos modelos de equipos portátiles, esta téc nica podría ser una herramienta importante que puede ser utilizada en los campos de cultivo para determinar el tiempo óptimo de cosecha.

Finalmente, la Fig. 4 muestra la comparación de los espectros Raman de un fruto maduro de color naranja obtenido por dos configuraciones diferentes. En el modo A, donde el láser incide de manera perpendicular a la superficie del ha banero incidiendo primero en el exocarpio (exterior) y el Modo B, en el cual el láser incide de manera paralela a la superficie del habanero. Con el modo B fue posible estudiar el endocarpio y el mesocarpio, sin la contribución del exocarpio. Se puede observar claramente que lo picos localiza dos en 2857 y 2908 cm^-1 desaparecen cuando el láser incide paralelo a la superficie del habanero, sobre la región del mesocarpio, debido a que con esta configuración se evita la contribución de la cutina del fruto, que no es otra cosa más que una capa superficial de cera transparente que ayuda a controlar la evaporación del agua que contiene el fruto. Esta capa superficial y externa es una mez cla de polisacáridos, ácidos grasos esterizados y compuestos alifáticos (^{Parsons et al., 2013}). Estas dos señales ya han sido estudiadas y asociadas a la cutina mediante espectroscopía infrarroja y Raman por otros autores en frutos de olivo (Lo pez-Sanchez et al., 2010) y tomate (^{Heredia-Guerrero et al., 2014}).

Fig. 3 Evolución de los espectros Raman de un fruto inmaduro de habanero amarillo (Mayan Kiin) durante 12 días. 

Fig. 4 Comparación de los espectros Raman del pericarpio del habanero de color naranja (Mayan Ek) obtenidos con el láser incidiendo perpendicular (negra) y paralelo (naranja) a la superficie del habanero. 

CONCLUSIONES

Se observó que cuando los frutos están in maduros los espectros Raman son dominados por señales originadas por la clorofila a y bacterioclorofila a, mientras que cuando el fruto está maduro los espectros Raman presentan tres picos muy intensos originados por los carotenoides responsables del color de los frutos. Además, se identificaron dos picos Raman que son origina dos por la cutina del fruto. Con este estudio, se amplía el conocimiento técnico que se tiene sobre el chile habanero y se presenta la técnica de espectroscopía Raman como una herramienta muy útil para el estudio de productos agrícolas.