INTRODUCCIÓN

En la actualidad el uso de agroquímicos es una de las herramientas más empleadas para el control de plagas en la agricultura. Sin embargo, el uso excesivo puede producir contaminación ambiental y desarrollo de plagas resistentes (^{Campos et al., 2016}). Por otra parte, los insecticidas botánicos han sido señalados como una alternativa al uso de insecticidas químicos, ya que suponen un menor riesgo para el ambiente o para la salud humana (^{Souza et al., 2008}). Además, algunos de estos plaguicidas botánicos ya se utilizan como productos de protección vegetal (Campos et al., 2016; ^{Harder et al., 2016}).

La infusión de las hojas de Minthostachys mollis (Kunth) Griseb. "Muña" (Lamiaceae), es empleada como un digestivo, antibacteriano, antihelmíntico y afrodisiaco (Hammond et al., 1998; ^{Carhuapoma et al., 2009}; ^{Torrenegra-Alarcón et al., 2016}). Esta planta arbustiva es nativa de Sudamérica, y habita entre 500 y 3500 msnm (^{Scandaliaris et al., 2007}).

Las hojas, semillas y frutos de Annona muricata L. "Guanábana" (Annonaceae), tienen propiedades astringentes, antiespasmódicas, para tratar contusiones y para eliminar piojos (^{Mayo, 2013}). Este árbol frutal es originario de América tropical. El fruto es una baya múltiple o sincarpo, con semillas ovoides comprimidas dorsalmente y de color pardo oscuro brillante

(^{Coto-Alfaro y Saunders, 2001}).

Las semillas de Lupinus mutabilis Sweet "Tarwi" (Fabaceae), tienen un alto valor nutricional, y son utilizadas para controlar garrapatas y parásitos intestinales en animales domésticos, debido a la presencia de alcaloides. Esta planta es una leguminosa que se cultiva habitualmente en las zonas altoandinas de Sudamérica (^{Jacobsen y Mujica, 2006}).

Los granos de Chenopodium quinoa Willd "Quinua" (Amaranthaceae), son usados en la alimentación humana debido a sus proteínas, aminoácidos esenciales y ácidos grasos. Además se le atribuye propiedades cicatrizantes, desinflamantes, analgésicas y desinfectantes (Mujica y ^{Jacobsen, 2006}). Esta planta anual es cultivada en mayor cantidad en los Andes de Perú y Bolivia.

Entre los insectos, Chrysoperla externa Hagen 1861, "león de áfidos", es un depredador eficaz en el manejo ecológico e integrado de plagas, pudiendo habitar un gran número de agroecosistemas (^{Núñez, 1988}; ^{Aud et al., 2001}; ^{Iannacone et al., 2007}). Las larvas son muy voraces y se alimentan preferentemente de insectos de cuerpo blando (^{Soto y Iannacone, 2008}). Por otro lado, se ha demostrado su sensibilidad frente a diversos pesticidas (^{Silva et al., 2012}; ^{Moura et al., 2012}), así como a productos botánicos (Iannacone y Lamas, 2002; ^{Medina et al., 2004}; Iannacone et al., 2015).

Por otra parte, Tetranychus urticae Koch, 1836, "arañita roja", es un ácaro polífago y cosmopolita que perjudica diversos cultivos de importancia económica a nivel mundial (^{Jeppson et al., 1975}, ^{de Moraes y Flechtmann, 2008}). Este ácaro presenta una rápida resistencia al uso de pesticidas, debido a que estos individuos tienen un ciclo de vida corto, abundante descendencia y reproducción de tipo arrenótoca (^{Van Leeuwen et al., 2010}).

La evaluación de la compatibilidad entre los extractos de plantas con propiedades insecticidas y el control biológico de plagas son esenciales para una estrategia de manejo integrado de T. urticae (^{Iannacone et al., 2015}; ^{Parolin et al., 2015}).

El objetivo principal de este estudio fue evaluar la toxicidad del extracto acuoso, etanólico y hexánico de las hojas de Minthostachys mollis "muña", semillas de Annona muricata "guanábana", Lupinus mutabilis "tarwi", y Chenopodium quinoa "quinua" sobre Tetranychus urticae y Chrysoperla externa para un posible uso en Manejo Integrado de Plagas (MIP).

MATERIALES Y MÉTODOS

Los bioensayos toxicológicos se realizaron en el Laboratorio de Parasitología de la Universidad Ricardo Palma (URP), Distrito de Santiago de Surco, Lima, Perú, durante el 2016.

Obtención del material vegetal

El material vegetal se adquirió en el mercado mayorista de Santa Anita, Lima, Perú. Se compraron 2 kg de plantas enteras de M. mollis provenientes de la ciudad de Concepción (Junín), ubicada a 3286 msnm. Las semillas de A. muricata se separaron de 3 kg de fruta madura. Finalmente, se consiguieron 500 g de semillas no lavadas de C. quinoa var. Blanca de Junín y 500 g de semillas no lavadas de L. mutabilis, provenientes de la ciudad de Sapallanga (Junín), ubicada a 3299 msnm. El material vegetal fue certificado por el Laboratorio de Diversidad-Vegetal de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática de la Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV), según el Sistema de Clasificación ^{Cronquist (1981}).

Obtención del material animal

Los huevecillos maduros de C. externa (3 millares) se adquirieron del Programa Nacional de Control Biológico, Servicio Nacional de Sanidad Agraria (PN-CB-SENASA), Lima, Perú, y se acondicionaron en tres recipientes plásticos de 8 L de capacidad hasta el momento de la eclosión. Las larvas del primer instar (< 24 h) recién emergidas se alimentaron con huevos de Sitotroga cerealella (Olivier, 1789) antes de su utilización en los bioensayos (^{Iannacone y Alvariño, 2010}).

Los especímenes de T. urticae se recolectaron semanalmente de plantas de Prunus persica L. "durazno", no tratadas previamente con insecticidas o acaricidas sintéticos, de parques del distrito de Santa Anita. Se usaron para los bioensayos únicamente hembras adultas de T. urticae, debido a que es uno de los estados de desarrollo más susceptible. La identificación de la especie se realizó en el Laboratorio de Entomología del Centro de Diagnóstico de Sanidad Vegetal del Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA), Lima, Perú. Se usaron solo ácaros machos para la confirmación de la especie (^{Ferragut y Santonja, 1989}).

Extractos vegetales

Las semillas de A. muricata y hojas de M. mollis se lavaron con agua potable para la remoción de las impurezas presentes, luego se secaron y colocaron en una estufa a 40°C por 48 h. Posteriormente se procedió a retirar el material vegetal de la estufa. Luego se removió la testa de las semillas de A. muricata, para obtener solo el endospermo. A continuación se procedió a triturar por separado el material vegetal seco con un mortero hasta la obtención de un polvillo fino. El tamaño de las partículas granulométricas del polvillo de las dos especies botánicas se determinó por un tamizaje de 250 u (US mesh = 60). Las semillas de C. quinoa y L. mutabilis no se sometieron al procedimiento descrito anteriormente de triturado y obtención de un polvillo fino, sino que previa limpieza de las impurezas presentes, las semillas se secaron en estufa. Finalmente, el material vegetal se colectó por separado en frascos de vidrio ámbar hasta la preparación de los extractos.

El extracto acuoso se obtuvo luego de pesar 20 g del material vegetal de M. mollis, A. muricata, C. quinoa y L. mutabilis con 100 mL de agua purificada no gasificada (Cielo®, AJEPER, Santiago de Surco, Lima, Perú) (pH = 7,79, potencial redox = 55 mV, conductividad = 54,5 uScm^-2, temperatura = 25°C, % saturación de oxigeno = 76,3%, Oxígeno disuelto = 6,17 mg L^-1) por 24 h a temperatura ambiente (^{Iannacone y Quispe, 2004}). El extracto etanólico se obtuvo luego de pesar 20 g del material vegetal de M. mollis, A. muricata, C. quinoa y L. mutabilis con 100 mL de etanol al 70% por 72 h a temperatura ambiente. El extracto hexánico se obtuvo luego de pesar 20 g del material vegetal de M. mollis y A. muricata con 100 mL de n-hexano a las mismas condiciones señaladas con el extracto etanólico. No se trataron las semillas de C. quinoa y L. mutabilis con este solvente apolar.

Los extractos botánicos se agitaron manualmente cada 8 h por 3 días durante el proceso de extracción. Transcurrido este tiempo, se filtraron usando un papel filtro (Whatman N°1). A partir del extracto inicial del 20% de concentración, se hizo una dilución para obtener la concentración del 10%. Finalmente, cada extracto vegetal se almacenó en frascos de color ámbar para su utilización en los bioensayos.

Bioensayos

Los bioensayos se realizaron por contacto residual en envases plásticos de 12 mL de capacidad (^{Iannacone et al., 2015}), a los cuales se les hizo pequeños orificios en la tapa para permitir la respiración de ambos artrópodos. El protocolo consistió en pasar un hisopo estéril previamente sumergido por 30 seg una sola vez en cada extracto vegetal, para luego ser esparcido homogéneamente por todas las paredes de cada recipiente plástico. Luego los envases con solvente etanólico y hexánico se secaron a temperatura ambiente por un intervalo de 3-4 h, mientras que los envases con solvente acuoso fue por 2 h (Iannacone y Alvariño, 2010).

Se utilizaron 10 hembras adultas de T. urticae por cada recipiente plástico y no se le suministró alimento durante la realización del bioensayo. Diez larvas del primer instar (< 24 h) de C. externa se colocaron individualmente en cada recipiente plástico, debido a que estos insectos presentan hábitos de canibalismo cuando escasea el alimento (^{Núñez, 1988}).

La temperatura y humedad relativa promedio del laboratorio fue de 28,6 ±1°Cy67± 2%, respectivamente. Los bioensayos se realizaron en condiciones de oscuridad para evitar la fotólisis de los extractos botánicos (^{Iannacone y Lamas, 2003}b; Iannacone y Alvariño, 2005). Las lecturas de mortalidad fueron a las 24 y 48 h para T. urticae, y a las 24, 48 y 72 h para C. externa. No se completó el bioensayo hasta las 72 h con T. urticae, debido a que hubo una mortalidad superior al 20% en el control. Se evidenció la muerte de ambas especies cuando estas no realizaron algún movimiento corporal coordinado al ser estimulados con un alfiler entomológico durante 15 s en su observación en el microscopio estereoscópico (Iannacone y Alvariño, 2005).

Diseño experimental y análisis de datos

Se usaron dos concentraciones (20% y 10%) de los extractos botánicos acuosos, etanólicos y hexánicos para las pruebas de toxicidad con T. urticae y C. externa, cada uno con cuatro repeticiones y un control de agua purificada no gasificada, alcohol etílico al 70% y n-hexano. El control no debió superar el 20% de mortalidad en los bioensayos. Se hizo un ajuste del control a 0% mediante la fórmula de Schneider-Orelli's derivada de la fórmula de Abbott (^{Fusé et al., 2013}), luego los datos obtenidos se transformaron según la expresión VxTT. Los estadísticos descriptivos se calcularon con el programa estadístico IBM SPSS Statistics versión 23. Se realizó el análisis de varianza (ANDEVA) y la prueba post hoc de Duncan con un nivel de significancia de p < 0,05, además se calcularon los valores de LOEC (Concentración más baja con efecto observado) y NOEC (Concentración sin efecto observado). Para todos los extractos a las 48 h de exposición, al ser la mortalidad de las hembras adultas de T. urticae y de las larvas del primer instar de C. externa, en la concentración del 10% del extracto estadísticamente igual al control, no necesitó adicionar una concentración al 5%, que es lo sugerido para calcular los valores de NOEC y LOEC (^{Castillo, 2004}). Finalmente, se determinó el cociente relativo de riesgo de selectividad (CRRS) adaptado de ^{Bahlai et al. (2010}), y ^{Stanley y Preetha (2016}) empleando la relación presa (T. urticae)/ depredador (C. externa) al no tenerse la dosis de aplicación recomendada en campo de los cuatro extractos botánicos para el control de T. urticae en diferentes cultivos agrícolas. El CRRS se calculó luego de dividir el porcentaje de mortalidad de T. urticae/C. externa a las 48 h de exposición en los bioensayos con ambas especies. Los valores mayores a 1 no representaron un riesgo adverso en la mortalidad de C. externa, mientras que los valores menores a 1 si ocasionaron un riesgo negativo en el depredador.

Análisis fitoquímico

Se realizó utilizando procedimientos estandarizados para la detección de alcaloides (Dragendorff), flavonoides (Shinoda), esteroides (Liebermann Burchard), grupos fenólicos (Tricloruro férrico) y saponinas (producción de espuma) (^{Lock, 1994}). La presencia de metabolitos secundarios se detectó en tres categorías: Muy abundante (++++), Abundante (+++), moderada (++), leve (+), ausencia (-), dudoso (±).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El extracto acuoso de M. mollis no presentó efectos acaricidas en hembras adultas de T. urti-cae a las 24 h de exposición y al 20% de concen tración. Los restantes extractos acuosos de las plantas evaluadas en los bioensayos presentaron efecto acaricida (Tabla 1). A las 48 h de exposi ción se observó un incremento de la mortalidad de ácaros, siendo el extracto acuoso de M. mollis al 20% de concentración el que presentó la mayor actividad acaricida (29,3%). La Tabla 2 muestra la presencia de los principales metabolitos secunda rios evidenciados mediante el análisis fitoquími co. Se detectó la presencia de alcaloides, flavonoi-des, esteroides, grupos fenólicos y saponinas, en los extractos botánicos empleados en los bioensa-yos (^{Dadé et al., 2009}). ^{Iannacone y Lamas (2003}a) indicaron la actividad repelente e insecticida de Minthostachys sp por infusión, planta y polvo seco en el lepidóptero Phthorimaea operculella (Zeller, 1873), además L. mutabilis presentó solo actividad insecticida por infusión y macerado.

Los extractos etanólicos de A. muricata y M. mollis en ambas concentraciones y a las 24 h de exposición no presentaron actividad acaricida, en cambio, los extractos de L. mutabilis y C. quinoa si presentaron efecto acaricida de 3,6% y 6,1%, al 20% de concentración, respectivamente (Tabla 3). A las 48 h de exposición se observó que el extracto de C. quinoa mostró la mayor actividad acaricida, la cual disminuyó a las 48 h de exposición por aumento de la mortalidad del testigo antes previo al ajuste del control con la fórmula Schneider-Orelli's (Tabla 3). Los metabolitos secundarios de esta especie botánica presentan actividad biológica debido principalmente a la presencia de saponinas (^{Woldemichael y Wink, 2001}, ^{Guzmán et al., 2015}). Los granos de quinua pueden tener una concentración de 0 a 6% de saponinas, según la variedad (^{Iannacone y Quispe, 2004}). ^{Tava y Odoardi (1996}) comprobaron la actividad insecticida de las saponinas de Medicago spp. sobre larvas del lepidóptero Lobesia botrana (Denis y Schiffermüller, 1775). ^{Harder et al. (2016}) evaluaron el efecto acaricida del extracto etanólico crudo de semillas de C. quinoa en hembras adultas de T. urticae por contacto residual, produciendo mortalidades entre el 89 91% a las 72 h de exposición con concentraciones de 7,6 y 9,1% (p/v). Se puede diferir con los autores según los métodos empleados, ya que ellos obtuvieron el extracto crudo de semillas a través de una extracción en Soxhlet, mientras que en este trabajo se usó la maceración de semillas en etanol, produciendo una mortalidad del 29% de los ácaros a las 24 h de exposición. Además, cabe mencionar que según el reporte de ^{Gandarillas (1967}), las semillas de C. quinoa var. Blanca de Junín presentan un bajo contenido de saponinas, lo que podría ser un factor determinante para sustentar la baja actividad acaricida menor al 20% según el criterio señalado por ^{Stanley y Preetha (2016}). Por otro lado, Iannacone y Quispe (2004) comprobaron una actividad insecticida de 7,5% de los extractos acuosos de C. quinoa sobre adultos del coleóptero Sitophilus zeamais (Motschulsky, 1855) en ensayos de contacto en papel filtro y con alimento. ^{Russo et al. (2011}) evaluaron el extracto acuoso de Chenopodium album L. en adultos y larvas del coleóptero Oryzaephilus surinamensis (Linnaeus, 1758) por medio de ingestión y obtuvieron un menor porcentaje de supervivencia en ambos estados de desarrollo. Los resultados obtenidos por ^{Zegarra (2010}) evidenciaron la actividad biológica del aceite esencial de C. quinoa var. Markjo en la oviposición de hembras y eclosión del ácaro Boophilus microplus (Canestrini, 1888).

Tabla 1 Toxicidad del extracto acuoso de Annona muricata, Minthostachys mollis, Lupinus mutabilis, y Chenopodium quinoa sobre Tetranychus urticae (Trombidiformes: Tetranychidae). Table 1. Toxicity of the aqueous extract of Annona muricata, Minthostachys mollis, Lupinus mutabilis, and Chenopodium quinoa against Tetranychus urticae (Trombidiformes: Tetranychidae). 

Tabla 2 Identificación de los principales metabolitos secundarios evidenciados en los extractos botánicos. Table 2. Identification of the main secondary metabolites found in the botanical extracts. 

Tabla 3 Toxicidad del extracto etanólico de Annona muricata, Minthostachys mollis, Lupinus mutabilis, y Chenopodium quinoa sobre Tetranychus urticae (Trombidiformes: Tetranychidae). Table 3. Toxicity of the ethanolic extract of Annona muricata, Minthostachys mollis, Lupinus mutabilis, and Chenopodium quinoa against Tetranychus urticae (Trombidiformes: Tetranychidae). 

Los extractos hexánicos de A. muricata y M. mollis no presentaron efecto acaricida significativo en comparación al control a las 24 y 48 h de exposición, en ambas concentraciones evaluadas (Tabla 4). Sin embargo, los resultados del presente trabajo difieren de los obtenidos por ^{Maciel et al. (2015}), quienes encontraron una mayor actividad acaricida del extracto hexánico de semillas de A. muricata en hembras adultas de T. urticae. Esto podría deberse al proceso de extracción, a las concentraciones empleadas y al método del bioensayo de toxicidad. Por otro lado, hasta la fecha no se tiene información sobre el efecto del extracto hexánico de M. mollis en este ácaro.

Los extractos acuosos de las cuatro especies botánicas evaluadas no presentaron efecto insecticida en larvas del primer instar de C. externa a las 24 h de exposición. A las 48 h de exposición se observó un efecto insecticida de 14,2% y 17,8% de los extractos de A. muricata y L. mutabilis. A las 72 h de exposición la mortalidad se elevó a 30,3% y 63,64% para los cuatro extractos botánicos, siendo el extracto de M. mollis al 20% de concentración el que produjo la mayor actividad insecticida, mientras que el extracto de C. quinoa al 10% de concentración registró la menor actividad insecticida con este solvente (Tabla 5). La toxicidad del extracto acuoso crudo de semillas de Annona squamosa L. se reportó anteriormente por ^{Leatemia e Isman (2004}), quienes indicaron actividad insecticida sobre larvas del primer instar de Chrysoperla carnea (Stephens, 1836) a las 24 y 48 h de exposición por contacto residual.

Los extractos etanólicos no presentaron efecto insecticida sobre C. externa a las 24 h de exposición. A las 48 h de exposición se observó un efecto insecticida de 15,2% con el extracto de C. quinoa (Tabla 6). A las 72 h de exposición la mortalidad sobre C. externa se elevó entre 43,3% y 75,6% para los cuatro extractos botánicos, siendo el extracto de M. mollis al 20% de concentración el que presentó la mayor actividad insecticida registrada en los bioensayos, mientras que el extracto de L. mutabilis al 10% de concentración presentó la menor actividad insecticida (Tabla 6). El análisis fitoquímico del extracto etanólico de M. mollis evidenció la presencia de flavonoides, grupos fenólicos y saponinas como los posibles metabolitos secundarios con actividad insecticida (Tabla 2). No se cuenta en la actualidad con información acerca de la actividad insecticida de esta especie botánica en C. externa.

Los extractos hexánicos de A. muricata y M. mollis no presentaron efecto insecticida significativo en C. externa en comparación con el control a las 24 y 48 h de evaluación. A las 72 h de exposición, solo el extracto de M. mollis produjo mortalidad de 23,5% y 26,4%, con ambas concentraciones evaluadas (Tabla 7). Se podría indicar que los metabolitos secundarios extraídos con este solvente apolar con estas concentraciones no son perjudiciales para este insecto como se ha observado con otras especies botánicas (^{Iannacone et al. 2007})

Tabla 4 Toxicidad del extracto hexánico de Annona muricata, y Minthostachys mollis, sobre Tetranychus urticae (Trombidiformes: Tetranychidae). Table 4. Toxicity of the hexanic extract of Annona muricata, and Minthostachys mollis, against Tetranychus urticae (Trombidiformes: Tetranychidae). 

Tabla 5 Toxicidad del extracto acuoso de Annona muricata, Minthostachys mollis, Lupinus mutabilis, y Chenopodium quinoa sobre Chrysoperla externa (Neuroptera: Chrysopidae). Table 5. Toxicity of the aqueous extract of Annona muricata, Minthostachys mollis, Lupinus mutabilis, and Chenopodium quinoa against Chrysoperla externa (Neuroptera: Chrysopidae). 

Los cocientes relativos de riesgo de selectivi dad (CRRSs) obtenidos con los extractos acuosos y etanólicos indican que éstos no produjeron un riesgo en la mortalidad de las larvas del primer instar de C. externa. Sin embargo, el CRRS del ex tracto hexánico de M. mollis al 20% de concentra ción evidenció un riesgo en la mortalidad de C. externa (Tabla 8).

El menor valor del CRRS se observó en el ex tracto acuoso de M. mollis al 20% de concentración y a las 48 h de evaluación (Tabla 9). Este resultado indicó que a esta concentración, el extracto botá nico no ocasionó un riesgo en la mortalidad de larvas del primer instar de C. externa en los bioen-sayos de toxicidad, además cabe mencionar que a esta concentración se observó un efecto acaricida del 30% de mortalidad en hembras adultas de T. urticae. Varios trabajos en la literatura científica han evaluado la selectividad de los extractos de plantas con propiedades insecticidas en los agen tes de control biológico para evaluar su compati

Tabla 6 Toxicidad del extracto etanólico de Annona muricata, Minthostachys mollis, Lupinus mutabilis, y Chenopodium quinoa sobre Chrysoperla externa (Neuroptera: Chrysopidae). Table 6. Toxicity of the ethanolic extract of Annona muricata, Minthostachys mollis, Lupinus mutabilis, and Chenopodium quinoa against Chrysoperla externa (Neuroptera: Chrysopidae). 

Tabla 7 Toxicidad del extracto hexánico de Annona muricata, y Minthostachys mollis, sobre Chrysoperla externa (Neuroptera: Chrysopidae). Table 7. Toxicity of the hexanic extract of Annona muricata, and Minthostachys mollis, against Chrysoperla externa (Neuroptera: Chrysopidae). 

CONCLUSIONES

El extracto acuoso de M. mollis y el extracto etanólico de C. quinoa, ambos al 20% de concentración podrían ser usados en un MIP de T. urticae, ya que fueron los únicos extractos botánicos que causaron mortalidad del ácaro en los bioensayos de toxicidad. Sin embargo, el extracto etanólico de M. mollis a las 72h de exposición en C. externa produjo una mortalidad muy elevada. El CRRS obtenido a las 48h de exposición, indicó que el extracto acuoso de M. mollis al 20% de concentración podría ser empleado en un entorno natural donde coexistan o se liberen las larvas del primer instar de C. externa y las hembras adultas de T. urticae, debido a que este extracto no resultó ser riesgoso en la mortalidad del depredador, pero si tóxico en la plaga; sin embargo, aún es necesario realizar ensayos en campo para obtener información detallada acerca de la actividad acaricida de esta planta y su empleo en conjunto con otras estrategias de control dentro de un MIP.

Tabla 8 Cociente relativo de riesgo de selectividad (CRRS) estimado de T. urticae/C. externa en mortalidades (%) obtenidas con los extractos botánicos. Table 8. Estimated relative risk quotient of selectivity (RRCS) of T. urticae / C. externa in mortalities (%) obtained with the botanical extracts. 

Tabla 9 Dos criterios de elección para emplear los extractos botánicos en un posible Manejo Integrado de Plagas de T. urticae.Table 9. Two selection criteria for using botanical extracts in a possible Integrated Pest Management of T. urticae.