Diversidad patogénica y características de Campylobacter spp.

El primer reporte de Campylobacter (kampulos, curvo; bacter, bacteria) fue realizado por Theodo re Escherich en 1886, quien observó y describió células no cultivables en forma de espiral, pero fue en 1906 identificada por primera vez por dos veterinarios británicos, John McFadyean y Stewart Stockman, quienes reportaron la presen cia de un gran número de un organismo peculiar en el mucus uterino de ovejas preñadas (^{Epps et al., 2013}).

Campylobacter spp., es un género bacteriano perteneciente a la familia Campylobacteraceae. Esta familia fue claramente descrita por P. Vandamme en 1992, quien señaló que también pertenecían a ella los géneros Sulfuruspirillum y Arcobacter. Dentro del género Campylobacter, se han descri to 25 especies bacterianas, correspondientes a C. fetus, C. coli, C. concisus, C. curvus, C. gracilis, C. helveticus, C. hominis, C. hyointestinalis, C. jejuni, C. lanienae, C. lari, C. mucosalis, C. rectus, C. showae, C. sputorum, C. upsaliensis, C. insulaenigrae, C. pelori-dis, C. avium, C. subantarticus, C. canadensis, C. cu-nicolurum, C. volucris, C. ureoliticus y C. troglodytis, con 8 subespecies (^{Lapierre, 2013}; ^{Kaakoush et al., 2015}).

Campylobacter spp. representa un grupo im portante de comensales de la mucosa intestinal y bacterias patógenas en humanos y animales. En animales, específicamente en aves, estas especies parecen no causar enfermedad, pero en humanos están asociadas con el desarrollo de patologías (^{Kaakoush et al., 2015}). Dentro de sus caracterís ticas, Campylobacter spp. corresponde a pequeños bacilos no formadores de esporas, de 0,2-0,8 um x 0,5-5 um, con una forma que varía de espiral, a varilla y curvados (Fig. 1), o bien como alas de gaviotas, dependiendo de la especie (^{Donnison y Ross, 2014}). Son móviles gracias a sus flagelos polares, ubicados en uno o los dos extremos de la bacteria (Fig. 1), donde las únicas excepciones son C. gracilis, que no es móvil, y C. showae, que posee múltiples flagelos (^{Silva et al., 2011}). Lapie-rre (2013) señala que estas estructuras participan en la patogenicidad de la bacteria, gatillado por la capacidad de adherencia e invasión a la célula eucarionte y la producción de citotoxinas.

Con respecto a sus mecanismos de patoge-nicidad, Campylobacter spp. invade la mucosa intestinal en forma similar a Shigella, llegando a la lámina propia a nivel de intestino delgado y colon, generando una enterocolitis inespecífica, con degeneración y atrofia glandular, pérdida de la producción de mucus, abscesos de las criptas intestinales y ulceración de la mucosa epitelial (ISP, 2014; ^{Bolton, 2015}).

En el caso de las citotoxinas, su toxina distensora citoletal (TDC) contribuye a aumentar la pa-togenicidad de C. jejuni. Este tipo de citotoxinas está ampliamente distribuida en Gram negativos, pero específicamente en Campylobacter spp. causa el arresto celular en fase M/G2 en células euca-riontes, evitando que estas desarrollen mitosis y llevándolas a la muerte celular (^{Bolton, 2015}). La TDC está compuesta por 3 sub unidades co dificadas por los genes cdtA, cdtB y cdtC. Se sabe que la sub unidad proteica CdtB, codificada por el gen cdtB, ingresa a la célula hospedera y se une en la superficie celular con las proteínas CdtA y CdtC, produciendo daño en el ADN celular (Sil va et al., 2011; Bolton, 2015). La subunidad que tiene el efecto tóxico es CdtB, la cual, debido a su actividad ADNasa, rompe el ADN y comienza en la célula el mecanismo de reparación que conclu ye con el arresto celular y la muerte de la célula. Por esto, C. jejuni puede prolongar la persistencia de la enfermedad gastrointestinal, aumentando la inflamación de la mucosa gastrointestinal y el daño hepático. Sin embargo, el efecto citopático puede variar desde un efecto muy importante, a estar ausente in vivo. Igualmente, la TDC es alta mente prevalente en Campylobacter spp. (^{Lapierre, 2013}).

Fig. 1 Microfotografía electrónica mostrando la morfología y la flagelación típicas de Campylobacter (^{Fernández, 2011}b). Fig. 1. Electron micrograph showing typical morphology and flagellation of Campylobacter. (Fernández, 2011b). 

Campylobacter spp. se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza. Suelo, estiércol, am bientes acuáticos y agua son los nichos naturales donde se suele encontrar, y desde aquí es capaz de generar infección en el humano (^{Whiley et al., 2013}). Una gran variedad de animales domésticos y de vida silvestre son su reservorio natural, tales como ganado vacuno, cerdos, ovejas, aves de co rral, cabras, perros, gatos y roedores, incluso en monos (^{Silva et al., 2011}; ^{Fernández y Oval, 2013}; ^{Koga et al., 2014}).

La dosis infectante de Campylobacter es de 10⁴ microorganismos, los que se multiplican en el in testino delgado, destruyen la mucosa intestinal, invaden el epitelio y producen inflamación con infiltración de leucocitos en la lámina propia, con presencia de leucocitos en las heces en el 25-80% de los casos (^{Silva et al., 2011}). Elementos estruc turales de C. jejuni como el flagelo, proteínas de superficie y lipopolisacáridos de superficie (LPS) le otorgan la capacidad de actuar como adhesi-na, y puede adherirse a las células epiteliales y al moco intestinal. Además, la forma curva o espiral y la atracción quimiotáctica del moco intestinal hacia la bacteria, facilita su contacto con el epite lio (^{Fernández, 2011}b; Silva et al., 2011).

Campylobacter spp. posee la capacidad de formar biopelículas en superficies inertes, tales como vidrio, acero inoxidable y plástico, así como también en agua y tejidos del hospedador, con el fin de asegurar su sobrevivencia, resistiendo es trés físico, biológico y medioambiental. Películas en el aire o en líquidos, cúmulos agregados a su perficies o flóculos desagregados, son las formas de persistencia y diseminación que utiliza el bio-film para resistir condiciones adversas, con flócu-los bacterianos que pueden sobrevivir por sobre 24 días a temperatura ambiental. Las biopelículas también protegen a las bacterias residentes de an tibióticos, defensas del huésped y bacteriófagos inmunes (^{Lapierre, 2013}; ^{Kaakoush et al., 2015}).

El cuadro clínico desarrollado por la infección con Campylobacter spp. es la campilobacteriosis, enfermedad de baja mortalidad y distribución mundial, que afecta a individuos de todas las razas, sexos y edades. Consiste en una enteritis que cursa con diarrea acuosa o sanguinolenta, nauseas, fiebre y dolor abdominal, con un cuadro autolimitado, que no suele durar más de 6 días (FDA, 2012; ^{Whiley et al., 2013}). Sin embargo, se ha reportado que 1% de los casos requieren hospitalización por complicaciones y con secue las post infecciosas, afectando principalmente al sistema nervioso, como es el caso del síndrome de Guillain Barré, polineuropatía inflamatoria desmielinizante, producto de una reacción au-toinmune de los anticuerpos contra Campylobacter spp., que dañan el tejido nervioso periférico. En otros casos puede existir artritis reactiva e incluso aborto (^{Kaakoush et al., 2015}).

La mayoría de los casos reportados de cam-pilobacteriosis se deben a las especies termo-tolerantes, principalmente C. jejuni, C. coli y C. lari, las cuales debido a su capacidad de crecer a 42°C, pueden invadir el organismo de animales de sangre caliente, inclusive humanos, y causar enfermedad, generando un cuadro clínico similar entre las diversas especies, pero difiriendo en su reservorio principal (Tabla 1) (^{Fernández, 2011}b; FDA, 2012; ^{Kaakoush et al., 2015}). ^{Wagenaar et al. (2014}) señalan que sobre un 90% de los casos de campilobacteriosis son causados por C. jejuni o C. coli, mientras que un pequeño número se debe a C. fetus. Sin embargo, el cuadro inducido por C. coli es detectado con menor frecuencia que C. jejuni en muchas zonas del planeta; mientras que en países desarrollados es responsable de 3-5% de los casos de diarrea producidos por Campylobacter termotolerante, en países en desarrollo puede llegar a 25% (FDA, 2012; ^{Donnison y Ross, 2014}).

C. jejuni, la causa más frecuente de infección en el hombre, comprende dos subespecies; C. je-juni subesp. jejuni y C. jejuni subesp. Doylei. La principal diferencia entre ellas radica en que C. jejuni subesp. jejuni crece mejor entre 37 y 42°C, la temperatura corporal aproximada de las aves (41°C a 42°C), y parece estar bien adaptada a esta especie, pues son las principales portadoras de la enfermedad (OIE, 2008; ^{Fernández, 2011}b). En contraste con Salmonella, no puede crecer fuera de un hospedador de sangre caliente, debido a la au sencia de un ambiente microaerofílico y a las tem peraturas poco adecuadas para multiplicarse, sin embargo, puede sobrevivir en el medio ambien te, según la especie de que se trate y condiciones medioambientales, tales como temperatura, luz, interacciones bióticas, concentración de oxígeno y nutrientes (EFSA, 2011). Se ha logrado determi nar que en condiciones de estrés ambiental, como una reducción de pH en el procesamiento o al macenamiento de alimentos, puede adquirir una forma cocoide, que corresponde a formas viables pero no cultivables de la célula vegetativa (VNC) que le permiten sobrevivir en condiciones des favorables por largos periodos de tiempo. Con respecto a la temperatura, al no poseer proteínas para el shock por frio, son incapaces de crecer bajo 30°C, mientras que crecen óptimamente en tre un pH de 6,5-7,5, lo que le permite subsistir en carne y leche (^{Silva et al., 2011}; ^{Bolton, 2015}).

Otras especies como C. concisus, C. lari y C. ureolyticus han adquirido importancia porque han incrementado su presencia tanto en humanos como en animales (^{Fernández, 2011}b).

Campylobacter spp. en alimentos de origen animal. Se piensa que la principal ruta de trans misión de Campylobacter spp. termotolerantes corresponde a carnes y subproductos cárnicos crudos. La microbiota intestinal y carne de las aves de corral, especialmente de pollos broiler, constituyen uno de los principales reservorios y fuente de infección de Campylobacter en el hom bre (^{Rivera et al., 2011}; ^{Zendehbad et al., 2015}). Gran cantidad de pollos en los planteles avícolas resultan infectados con Campylobacter spp., ya sea por hábitos como la coprofagia, contaminación de alimentos y agua con las heces, o por contacto fecal-oral entre los individuos, no presentando signos clínicos, y pasando desapercibidos en los controles sanitarios tradicionales. Posteriormen te, cuando el ave infectada es llevada a matadero, el microorganismo puede pasar desde los intesti nos a la musculatura, en el proceso de la evisce-ración, contaminando la carne (^{Silva et al., 2011}; ^{Riley et al., 2015}; Zendehbad et al., 2015). Sin em bargo, en un estudio para determinar el nivel de contaminación en canales de pollos broiler con C. jejuni, realizado por ^{Gruntar et al. (2015}), se detectó una mayor contaminación en la fase pos terior al desplume, lo que sugiere que la conta minación más importante se produce antes de la entrada a la sala de evisceración, debido a la corta duración de la fase de escaldado (a 54°C) y la con secuente sobrevivencia de especies de Campylo-bacter en la canal, posterior al desplume. Aunque todas las especies de aves de consumo pueden contener Campylobacter spp., el riesgo de transmi sión alimentaria es mayor en el pollo, debido a las grandes cantidades comercializadas por la in dustria avícola (CDC, 2014; ^{Marotta et al., 2015}). Debido a que el bovino también es un reservorio de Campylobacter spp., la carne es considerada un alimento afecto a la contaminación con este pa tógeno, ya sea directamente o por contaminación ambiental (^{Fernández y Hitschfeld, 2009}).

En el caso de la industria lechera, la leche pue de contaminarse con este patógeno a través de la ubre, o bien en la extracción, por tanto la leche no pasteurizada representa un posible vehículo de transmisión de Campylobacter spp. (^{Fernández y Hitschfeld, 2009}; ^{Rivera et al., 2011}).

Campylobacter spp. en aguas. Las aguas super ficiales y cauces de agua pueden estar contaminadas por la presencia de heces infectadas de va cunos o aves, transmitiendo el patógeno a otros animales o incluso a personas que consuman es tas aguas contaminadas (^{Whiley et al., 2013}).

Campylobacter spp. en vegetales. Se ha podido determinar la presencia de C. jejuni en vegetales almacenados a 4°C, especialmente verduras de hoja verde, tales como lechugas (Lactusa sativa), espinacas (Spinacia oleracea) y perejil (Petroselinum crispum), asociándose la intoxicación al consumo de vegetales crudos (^{Guévremont et al., 2015}). Esto afirmaría la teoría que Campylobacter spp. puede sobrevivir a temperatura de refrigeración en diferentes medioambientes biológicos por lar gos periodos, por medio de respuestas adaptati vas al frio (^{Duffy y Dykes, 2006}; Guévremont et al., 2015).

Por lo anterior, la aplicación de buenas prácti cas de higiene en la granja y de manufactura de alimentos, tanto en industria como en el hogar, son necesarias para evitar la presencia de Campylobacter spp. en la cadena alimentaria.

Prevalencia de Campyobacter spp. a nivel in ternacional. Este género es reconocido como los mayores patógenos bacterianos desde mediados de 1990 en el humano, donde los métodos de de tección perfeccionados permitieron su registro en Europa y Norte América (^{Whiley et al., 2013}); C. jejuni es la especie que mayor cantidad de casos genera dentro del género (^{Kaakoush et al., 2015}). Tanto en EE.UU. como en Inglaterra, Campylobacter se aísla con mayor frecuencia que Salmonella y Shigella, mientras que en Dinamarca constitu ye la causa más común de enfermedad zoonóti-ca transmitida por alimentos (^{Gilliss et al., 2013}; ^{Rossi et al., 2015}). Whiley et al. (2013) aseveran que cerca de un 80% de los casos de Campylobac-ter en EE.UU. en un año típico corresponden a ETAs, por tanto, los alimentos constituyen una de las principales fuentes de infección. Se estima que afecta a 1,3 millones de personas cada año en EE.UU., con un incremento de 14% en la inciden cia de campilobacteriosis en el 2012 con respecto a los años 2006-2008, superando a otros patóge nos alimentarios, tales como Cryptosporidium, Lis-teria, Salmonella, Shigella y E. coli O157:H7 Shiga toxigénica (Gilliss et al., 2013; Rossi et al., 2015).

Los datos de ^{Thomas et al. (2013}) reportan una incidencia de 145.000 casos en los 32,5 millones de habitantes en Canadá, lo que ubica a C. jejuni como el tercer agente patógeno alimentario de mayor importancia en este país, luego de no-rovirus y Clostridium perfringens.

En la Unión Europea, el número de casos con firmados de campilobacteriosis el año 2012 fueron 214.000, con un promedio de 55 casos por 100.000. ^{Little et al. (2010}) señalan que se reportaron 50000 casos de campilobacteriosis en Inglaterra y Gales durante el año 2008, habiendo una tendencia al alza para el año 2009, con un 17% más de casos que el año anterior. En Alemania, 70.560 casos fueron reportados el 2011, lo que significó una prevalencia mayor que Salmonella, Shigella, Yersinia y Listeria (^{Kaakoush et al., 2015}) Por otro lado, en el 2010 fue la ETA más frecuentemente notifi cada en Australia, con 16.968 casos en todos los estados (OzFoodNetWorkingGroup, 2012).

Los estudios realizados en países asiáticos arrojan resultados similares al resto del mundo. En China, la investigación de la etiología de gas troenteritis en tres hospitales de Yangzhou entre el 2005 y 2006 muestran que 14,9% de los pacien tes con gastroenteritis fueron positivos a Campylobacter, con 4,84% de 3.061 pacientes con diarrea positivos a C. jejuni, en un hospital en Beijing en un estudio entre 2005-2009. (^{Huang et al., 2009}; ^{Chen et al., 2011}).

En India, un estudio en un hospital de Calcu ta, indica que en el periodo entre enero del 2008 y diciembre del 2010, 7% de los hospitalizados por gastroenteritis fueron positivos a especies de Campylobacter, con un 70% de los aislados que identificaron a C. jejuni como agente causal. En esta región de India, la campilobacteriosis es más prevalente en niños bajo 5 años (^{Mukherjee et al., 2013}). Los estudios avalan que los infantes pre sentan la mayor cantidad de aislados positivos a C. jejuni y C. coli, siendo endémicos en la po blación pediátrica, y que adultos jóvenes de sexo masculino también presentan alta cantidad de aislados positivos. Finalmente, los estudios indi can que la campilobacteriosis ocurre en las zonas cálidas con mayor frecuencia durante los meses de verano (^{Mason et al., 2013}; ^{Rossi et al., 2015}; ^{Zendehbad et al., 2015}).

En América Latina, las especies termotoleran tes de Campylobacter son agentes importantes de diarrea, pero se encuentran en un porcentaje me nor que E. coli enteropatógeno y Shigella, que son predominantes en estas zonas, donde la transmi sión a través del agua y el contacto directo con animales infectados son las principales vías de in fección en seres humanos (^{Fernández, 2011}a; ISP, 2014). Fernández (2011a) señala que un hallazgo frecuente en esta región del mundo es la presen cia de portadores sanos y alto grado de deshidra-tación de los enfermos, lo que no ocurre en países industrializados, asociado a bajas condiciones de saneamiento básico y bajo estatus nutricional, transmitiéndose especies diarreogénicas de Campylobacter a niños de corta edad. Otra situación que denotan los investigadores, es que C. jejuni y C. coli son la principal causa de diarrea de los viajeros. La CDC señala que aproximadamente un 19% de los casos de Campylobacter spp. iden tificados en FoodNet están asociados con viajeros de países desarrollados en países en desarrollo (CDC, 2014; ^{Zendehbad et al., 2015}).

Prevalencia de Campylobacter spp. a nivel na cional. En Chile, debido a que la mayoría de los laboratorios no está preocupado de estudiar este agente, sumado a la falta de implementación de técnicas diagnósticas, la notificación y derivación de Campylobacter spp. hacia los laboratorios de referencia es baja. Esto a pesar que desde el año 1983, Campylobacter spp. es agente de vigilancia de laboratorio según lo establece el reglamento sobre notificación de enfermedades transmisibles de declaración obligatoria. Por lo demás, no está incluido dentro del RSA chileno, por tanto no existen márgenes regulatorios precisos sobre los límites en los que Campylobacter spp. resulta noci vo al ser ingerido en alimentos (MINSAL, 2011).

Estudios realizados en Chile demuestran una alta prevalencia de Campylobacter spp. en los ali mentos. En un estudio en mataderos nacionales, se determinó un 72% de prevalencia en canales de pollos broiler en 2 de 4 de los mataderos estudia dos, posterior a la etapa de evisceración (^{Figueroa et al., 2009}). Por otra parte, en un estudio para de terminar la prevalencia de Campylobacter spp. en el territorio nacional, el ISP (2014) confirmó 462 muestras positivas, en un periodo comprendido entre enero del 2005 y agosto del 2013, con mayor cantidad de cepas positivas el 2011. El detalle de este estudio señala que un 93,5% de las cepas con firmadas provenían de la Región Metropolitana, mientras que solo un 1,5% provenía de Arica y Parinacota; 1,5% del Biobío y 1,3% del Libertador B. O'Higgins, con mayor prevalencia en el géne ro masculino y en niños de 1-9 años, dominando ampliamente C. jejuni por sobre C. coli y C. fetus (ISP, 2014).

Antecedentes sobre resistencia antibiótica de Campylobacter spp.

La resistencia antibiótica de Campylobacter spp. es considerada por la OMS como un serio problema en salud pública (^{Rossi et al., 2015}). La administración de concentraciones bajo la dosis bactericida a poblaciones susceptibles, puede conllevar a mutaciones en la especie bacteriana, desarrollando la resistencia a determinado anti biótico, donde la dinámica de la resistencia a anti microbianos es altamente dependiente de la clase de antibiótico, concentraciones administradas y mutaciones relacionadas con cada agente antimi crobiano. Esto debido al surgimiento de variadas especies de Campylobacter zoonótico a partir de animales domésticos, y de la transmisión del pa tógeno resistente a alimentos de consumo huma no. A raíz de esta situación, se desencadena una mayor duración de la enfermedad, riesgo de en fermedad invasiva y muerte, así como aumento de los costos en el cuidado de la salud (^{Bolton, 2015}; ^{Kaakoush et al., 2015}; Rossi et al., 2015).

El desarrollo de resistencia antibiótica se ge nera principalmente en el intestino de las especies animales que son reservorio para Campylobacter spp., sobre todo en aquellas que son blanco del uso desmedido de antibióticos. Cepas resistentes son capaces de transmitirse fácilmente a través del medio ambiente, por ejemplo, vía plantas de tratamiento de aguas residuales de desechos humanos y animales, transmitiéndose también fácilmente entre especies, por ejemplo entre aves domésticas, aves silvestres y el ser humano. En este sentido y por razones desconocidas, cepas de C. coli aisladas desde aves de consumo y otros animales, parecen tener una multirresistencia an tibiótica más importante incluso que cepas de C. jejuni (^{Rossi et al., 2015}).

Por lo anterior, es esencial abordar el gran dilema de aplicar un tratamiento antibiótico en individuos enfermos, considerando que los anti bióticos solo están recomendados en casos graves o en individuos inmunocomprometidos, donde existan síntomas tales como fiebre, diarrea sangui nolenta, bacteremia, inmunocompromiso, riesgo de infección en embarazo, presencia de más de 8 episodios diarreicos en 24 h, o bien, persistencia de síntomas por más de 7 días (FDA, 2012; ^{Whiley et al., 2013}; ^{Kaakoush et al., 2015}). A raíz de esto, ^{Rossi et al (2015}) especifican que países desarro llados como EE.UU., Suiza, Australia, Finlandia y otros países del norte de Europa, controlan estric tamente el uso de antibióticos en medicina veteri naria, por tanto poseen actualmente bajos niveles de resistencia antibiótica. Sin embargo, conside rando pacientes que han realizado viajes interna cionales, es posible la propagación de patrones de resistencia hacia sectores desarrollados.

Con respecto a los mecanismos utilizados por Campylobacter para la adquisición de resistencia antibiótica, estos son similares al resto de las bac terias Gram negativas. Los antibióticos común mente asociados con la adquisición de resistencia antibiótica son las fluoroquinolonas, macrólidos, tetraciclinas, aminoglicósidos y betalactámicos, donde el esquema general para tratar a los pa cientes con campilobacteriosis corresponde a eri-tromicina (macrólido) en niños y ciprofloxacino (fluoroquinolona) en adultos (Fig. 2) (FDA, 2012; ^{Kaakoush et al., 2015}; ^{Rossi et al., 2015}). Alteracio nes del sitio de unión del antibiótico al patógeno, por medio de la expresión de genes que alteran dicho sitio; bomba de eflujo CmeABC, para esti mular la salida del fármaco desde la célula bac teriana; enzimas que contrarrestan o anulan al antibiótico y su efecto; y alteración de la permea bilidad de membrana por la expresión de porinas de membrana externa (MOMP), son los principa les mecanismos de resistencia bacteriana a estos antibióticos (Fig. 2). (^{Rivera et al., 2007}; ^{García et al., 2009}; ^{Kim et al., 2010}; Pollet et al., 2012; Iovi ne, 2013; Kaakoush et al., 2015; Rossi et al., 2015). Debido a que estos mecanismos muchas veces no son antibiótico específicos, es que se ha desarro llado además una multirresistencia de especies termotolerantes de Campylobacter hacia estos an timicrobianos (^{González-Hein et al., 2013}; ^{Bolton, 2015}; ^{Zendehbad et al., 2015}).

Es por todo lo anterior que Campylobacter es vigilado constantemente en la Unión Europea, EE.UU. y Canadá, para poder planificar méto dos para combatir la resistencia antibiótica de Campylobacter spp. (ISP, 2014; ^{Rossi et al., 2015}). En Chile aún existen muy pocos estudios que analicen la resistencia antibiótica en Campylo-bacter spp., por lo que se hace necesario consi derarlo como una problemática mayor para la salud pública nacional. Preocupantemente, fluo-roquinolonas y macrólidos están autorizados de acuerdo al registro de medicamentos veterinarios del Servicio Agrícola y Ganadero, y también se utilizan en medicina humana. Se sabe también que la cantidad de antibióticos del grupo de las fluoroquinolonas destinados a uso veterinario es muy superior al que se usa en medicina humana (^{Rivera et al., 2007}; ^{García et al., 2009}; ^{Kaakoush et al., 2015}). Es por esto que es necesario incen tivar prácticas que reduzcan el desarrollo de re sistencia antibiótica en salud animal y humana, evitando el uso profiláctico y como promotor de crecimiento de antibióticos e integrar a las espe cies termotolerantes de Campylobacter a vigilancia como agentes resistentes a antimicrobianos en el Dto. N° 158/2004, para mejorar el control de Cam-pylobacter resistente a antibióticos en alimentos (MINSAL, 2014).

Fig. 2 Esquema que representa los blancos celulares de la actividad antimicrobiana y los mecanismos de resistencia antibiótica (Modificado de Rossi et al., 2015). Fig. 2. Scheme representing the cellular targets of antimicrobial activity and mechanisms of antibiotic resistance (Modificadode ^{Rossi et al., 2015}).  

Métodos de detección de Campylobacter spp. Campylobacter spp. no es fermentador de carbohidratos y se nutre de aminoácidos. Por tanto, los medios para su detección deben ser ri cos en nutrientes aminoacídicos, con una mezcla antibiótica que inhiba a contaminantes fecales y permita la selección de Campylobacter spp. (FDA, 2012; CDC, 2014). La detección de las especies ter-motolerantes de Campylobacter es compleja, y re quiere de varios métodos combinados para lograr sensibilidad y especificidad. ^{Whiley et al. (2013}) señalan que son 3 los métodos de identificación clásicos: el cultivo tradicional por medio de agar selectivo, filtración por membrana en el agar san gre, y métodos moleculares de detección.

Cultivo, filtración por membrana y métodos confirmativos. El protocolo recomendado por la ISO 10272 (2006) para Campylobacter spp. señala que se necesita llevar la bacteria a caldo selectivo para luego sembrar en agar de cultivo selectivo. Con respecto a ello, el caldo Preston, o bien, el caldo Bolton, son medios selectivos de enrique cimiento de las especies termotolerantes de Campylobacter spp. que afectan alimentos (^{Habib et al., 2011}). Luego, la muestra debe ser llevada a cultivo en agar selectivo Skirrow, donde las colo nias positivas toman una coloración rosado páli do, aspecto redondeadas, con un borde regular, convexo, liso y brillante. Por otra parte, el agar selectivo desoxicolato-cefaperazona-carbon mo dificado (agar mCCD), recomendado por la ISO 10272 (2006) genera colonias grisáceas, planas y húmedas, con tendencia a expandirse, y un bri llo metálico, en muchos casos (OIE, 2008; Habib et al., 2011). Ya que se produce el crecimiento de flora acompañante, el método de filtración por membrana, el cual filtra las muestras a través de una membrana de celulosa triacetato, separa a Campylobacter spp. de otras especies bacterianas de rápido crecimiento, que puedan desarrollarse en el agar. El problema en este medio, es que la bacteria tiende a entrar en un estado viable no cultivable (VNC) (OIE, 2008; Habib et al., 2011; ^{Whiley et al., 2013}).

Para la confirmación, pruebas como motilidad positiva, catalasa y oxidasa positiva, crecimiento microaeróbico a 25°C, o crecimiento aeróbico a 42°C, permiten confirmar a especies termotolerantes de Campylobacter. La hidrolisis de hipurato permite diferenciar a C. jejuni del resto de las especies termotolerantes (Tabla 2) (OIE, 2008; ^{Habib et al., 2011}; ^{Donnison y Ross, 2014}).

Métodos moleculares. El PCR en tiempo real, es una técnica altamente sensible que amplifica el ADN bacteriano e indica instantáneamente la cepa bacteriana, ayuda a delinear a nivel de espe cie en Campylobacter, identificando además esta dos VNC, con resultados en un día. Sin embargo, puede conllevar a una sobre estimación del re cuento, debido a la amplificación en estado VNC o muerto, pues se ha demostrado que el ADN bacteriano es muy estable, y puede persistir por 14 días en sedimento marino y agua salada. Es por ello que para mejorar la detección de células vivas intactas, se utiliza la técnica de etidio monoácido (EMA) en conjunto con el PCR en tiempo real. EMA se une al ADN que no está protegido por una membrana celular y así evita la amplifi cación y enumeración de células amorfas, mejo rando la eficacia de las técnicas moleculares (OIE, 2008; ^{Whiley et al., 2013}).