INTRODUCCIÓN
En producción animal los antibióticos han sido ampliamente utilizados con fines terapéuti cos, de prevención y de promoción del crecimien to. Sin embargo, debido a la emergencia y propagación de bacterias resistentes a antibióticos, se ha prohibido en algunos países su incorporación en alimentación animal (Huyghebaert et al., 2011), reemplazándose por alternativas no terapéuticas, entre las que se cuenta la inclusión de extractos vegetales, que permiten aumentar la ganancia de peso (Mc Dermott et al., 2002). En producción de pollos de carne no sólo es importante mejorar la eficiencia de la producción, sino también lograr extender la vida útil de la carne, ya que es un pro ducto altamente perecible (Chouliara et al., 2007). La oxidación de los lípidos en la carne de pollo se produce durante el almacenamiento y proce samiento de la carne. La formación de productos secundarios en la oxidación afecta las caracte rísticas sensoriales, como sabor y aroma, lo cual se relaciona con la disminución de su vida útil (Mohamed y Mansour, 2012). En la industria ali mentaria se han utilizado antioxidantes sintéticos como butil-hidroxitolueno (BHT), butil-hidro-xianisol (BHA) y terbutil-hidroquinona (TBHQ) para retardar la oxidación de lípidos (Fasseas et al., 2007). Sin embargo, existe preocupación por la utilización de estos antioxidantes sintéticos por su riesgo de toxicidad (Okubo et al., 2003; Rodrí guez et al 2012).
La carne, además de la oxidación, se puede contaminar con microorganismos que causan enfermedades de transmisión alimentaria (ETAs) durante el procesamiento y almacenamiento en refrigeración, razón por la cual se han buscado alternativas para extender la vida útil de estos productos (Solomakos et al., 2008). Entre estas al ternativas se destaca la utilización de productos naturales que inhiben el crecimiento de patóge nos (Solomakos et al., 2008; Nieto et al., 2010).
El orégano (Origanum vulgare L.) es una planta aromática que pertenece a la familia Lamiaceae. El aceite esencial (AE) del orégano es conocido por poseer propiedades antimicrobianas (Marino et al., 2001; Friedman et al., 2002), debido a que sus principales componentes son compuestos fenólicos que tienen la capacidad de interactuar con la membrana citoplasmática, provocando la inestabilidad de bacterias y posterior muerte ce lular (Dorman and Deans, 2000; Lambert et al., 2001). Los principales constituyentes del AE de orégano son el carvacrol, timol, ρ-cimeno y ץ-terpineno (Bonfanti et al., 2012; De Falco et al., 2014). Se ha demostrado la actividad antimicrobiana del AE de orégano en estudios realizados in vitro contra bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, tales como Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Salmo nella typhi Ty2, entre otras (Elgayyar et al., 2001; Lambert et al., 2001; Lv et al., 2011; De Falco et al., 2014). Las bacterias Gram-negativas han sido más resistentes a la acción del AE de orégano, debido a la presencia de una membrana externa de lipo-polisacáridos que actuaría limitando el acceso de los compuestos activos presentes en el AE (Burt, 2004). Existen estudios que han demostrado la ac tividad antibacteriana del AE de orégano en carne de pollo durante la refrigeración, obteniendo una reducción del recuento total de microorganismos, y también de Pseudomonas, enterobacterias y bac terias ácido lácticas (Chouliara et al., 2007; Oral et al., 2009).
Los antioxidantes naturales se pueden incor porar en la dieta de los animales, aplicarlos en la superficie de la carne o utilizarlos en envases ac tivos para mejorar la calidad de la carne (Velasco et al., 2010). Se ha logrado extender la vida útil de la carne de pollo durante la refrigeración utili zando AE de orégano en el envasado de la carne (Chouliara et al., 2007; Oral et al., 2009). También existen estudios que han demostrado que el AE de orégano incorporado en la dieta de animales es capaz de mejorar la estabilidad oxidativa de la carne de ave durante el almacenamiento en refri geración (Botsoglou et al., 2002; 2003a; 2003b). La suplementación de la dieta de animales con an tioxidantes naturales es una estrategia simple y conveniente para incorporar compuestos antioxi dantes en la carne, sin la necesidad de tener un etiquetado especial del producto final (Botsoglou et al., 2002).
El objetivo de este estudio fue determinar la estabilidad durante el almacenamiento de carne de pollos alimentados con diferentes dosis de orégano seco en la dieta.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tratamientos
Se utilizaron 20 pollos de engorda por trata miento (5 pollos por repetición), híbrido Rock 308 de 45 g sin sexar y vacunados contra bronquitis aviar, de 1 día de edad. Los animales se alimentaron durante 42 días en total, tres semanas en eta pa de crianza y tres semanas en etapa de engorda. Los niveles de incorporación de orégano seco a la dieta fueron determinados según los resultados obtenidos en otros estudios en corderos (Bampidis et al., 2005) y en pollos (Botsoglou et al., 2002; Botsoglou et al., 2003a). Se utilizó una dieta con trol y dietas con orégano seco al 1,25; 2,5; 3,75 y 5%, con respecto a la materia seca, con 4 repeticio nes cada uno. El orégano, procedente de la Pro vincia de Ñuble, se adquirió en el mercado local.
La formulación de la dieta control se realizó de acuerdo a los requerimientos establecidos por NRC (1994). Se seleccionaron al azar 4 animales del total de 20 pollos por tratamiento (1 pollo por repetición) para realizar los análisis de la carne, obteniendo músculos pectorales y muslos de cada uno. La carne se envasó en bolsas de polie tileno, se mantuvo en refrigeración (2°C) duran te una semana después de la faena, y luego en congelación durante 1 mes (-18°C). Se determinó la composición de la carne de pollo y su acepta ción, y durante el almacenamiento se determinó: oxidación de lípidos (índice de peróxidos, IP), recuento de aerobios mesófilos (RAM) y color (espacio CIELab).
Determinaciones
Índice de peróxidos. Se extrajo una muestra de carne de 150 g de muslo de cada tratamiento para determinar el índice de peróxidos en dupli cado, los día 0 y 7 (refrigeración a 2°C). La deter minación se realizó según la metodología descrita por Pearson (1986). Este método consiste en la ex tracción de lípidos de la carne de pollo mezclada con 250 mL de cloroformo en agitación por 3 mi nutos. La solución es filtrada 2 veces con un papel con 1 g de sulfato sódico anhídrido. Posterior mente, se añade 37 mL de ácido acético glacial al 100 % y 1 mL de solución saturada de KI a 25 mL del doble filtrado. Se deja en reposo la solución durante 1 minuto en oscuridad y se agrega 30 mL de agua destilada, y 1 mL de almidón de papa (Merck) en 99 mL de agua, al 1 % peso volumen como indicador y se titula con (solución acuosa) de tiosulfato sódico 0,01 N. El índice de peróxidos (IP) en meq kg-1 se calculó según la ecuación:
dónde V es el volumen (mL) de tiosulfato sódico; C es la concentración del tiosulfato sódico (0,01N) y m es el peso de la muestra (kg de grasa).
Recuento de aerobios mesófilos (RAM). Mues tras de carne (músculos pectorales y muslos) de cada tratamiento se analizaron los días 0, 3 y 7, durante su refrigeración, según la metodología descrita por Quinn y Markey (2005). Se realizó una homogenización de 10 g de muestra en 90 mL de agua peptonada (Merck) y se realizaron dilu ciones seriadas. Posteriormente, se inocularon placas Petri con medio Plate count y se incubaron en condiciones de aerobiosis a 37°C por 24 horas. Finalmente, se realizó el recuento de colonias de microorganismos mesófilos aerobios.
Determinación de color. Se midió en carne de músculos pectorales y muslos en 4 muestras de cada tratamiento, en triplicado, los día 0, 3 y 7 durante su refrigeración. Se utilizó un coloríme tro de reflectancia (Hunter Lab 45/0 Color Quest, Hunter Associates Laboratory Inc., Reston, Virgi nia, USA) que mide las coordenadas de color del espacio CIELab, donde, a* mide la intensidad de rojo desde a+ (rojo) hasta a- (verde), b* mide la intensidad del amarillo desde b+ (amarillo) hasta b- (azul) y L* indica luminosidad de 0 (negro) a 100 (blanco). Se determinó el croma (C*), el án gulo de tono (h*) y la diferencia de color (AE) de la carne con el control, a través de las siguientes ecuaciones (Hunter Associates Laboratory, 2008)
Análisis composición nutricional. Para carac terizar la carne de pollo se realizó un análisis proximal, para lo cual se extrajo 100 g de mús culos pectorales y 100 g de muslos por separado de cada tratamiento, en duplicado, utilizando los siguientes métodos: Humedad: mediante secado en liofilizador (Christ Alpha 1-4 LD Plus, Oste-rode, Germany) a -65°C por 48 h. Proteínas: por el método de Kjeldhal, según el método 981.10 (AOAC, 1997). Lípidos: determinado como ex tracto etéreo, mediante el método 960.39 (AOAC, 1997). Minerales: a través de la determinación de cenizas, según el método 920.153 (AOAC, 1997).
Evaluación sensorial. Se conformó un panel de 16 degustadores, de los cuales 9 tenían categoría de "especializados", pertenecientes a una empre sa productora de carne de aves, y 7 con catego ría "no especializados". La muestras de carne de músculo pectoral de pollo congeladas a -18°C (1 mes después de la faena) se descongelaron (24 h a 2°C) y se cortaron en trozos de 2,0 x 3,0 cm, con un peso entre 6,5 a 7,5 g. Luego, se sometieron a cocción en un horno eléctrico a 190°C por 15 minutos aproximadamente, hasta que la tempe ratura interna alcanzó 75°C. Posteriormente, las muestras se depositaron sobre recipientes blan cos, identificadas con un código de 3 dígitos al azar. Cada panelista evaluó una muestra de cada tratamiento, utilizando agua entre cada muestra. Se evaluaron las características sensoriales de co lor, aroma y aceptación, mediante una escala de evaluación (Tabla 1) (Wittig de Penna, 2001).
Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar con cinco tratamientos y cuatro repeti ciones para cada tratamiento. Los datos fueron sometidos a análisis de varianza al 5% de signifi cancia. En el caso de presentarse diferencias sig nificativas, los datos fueron sometidos al test de contraste de Duncan al 5% de significancia. Los supuestos del análisis de varianza fueron veri ficados a través de los test de Shaphiro - Wilks modificado para la normalidad y Bartlet para la homogeneidad de varianza, ambos al 5% de sig nificancia. Para el análisis sensorial se utilizó un diseño completamente al azar con 16 repeticio nes, donde cada juez fue una repetición. Tanto para la evaluación sensorial como para el recuen to de aerobios mesófilos se utilizó el análisis de varianza no paramétrico de Kruskal - Wallis al 5% de significancia y como test de contraste se utilizó el propuesto por Conover al 5% de significancia. El software que se utilizó fue InfoStat professio nal versión 2008 (Balzarini et al., 2008).
Oxidación de lípidos
La lipoperoxidación o enranciamiento ocurre por acción de sustancias denominadas radicales libres (RL) que poseen uno o más electrones des apareados. Los RL sustraen un hidrógeno de un ácido graso, generalmente poliinsaturado que posee múltiples dobles enlaces, entre los cuales existen grupos metileno (CH2), cuyos hidrógenos son reactivos. De esta forma el RL se estabiliza y el ácido graso se convierte en un radical lipídico (L), el cual en presencia de oxígeno se transforma en un radical lipoperóxido. Este radical lipope-róxido buscará estabilizarse sustrayendo un H a un ácido graso vecino transformándose de esta manera en un lipohidroperóxido (LOOH). Todo lo anterior genera una reacción en cadena, de nominada lipoperoxidativa, que produce la oxi dación progresiva de los lípidos presentes en la carne (Richards et al., 2002, Chaijan, 2008).
La influencia de la suplementación con oréga no seco en la oxidación de lípidos durante el almacenamiento de carne de muslo de pollo se pue de observar en la Fig. 1. Los análisis de oxidación de lípidos se realizaron en el muslo, debido a que el contenido de grasa es mayor en este corte que en el músculo pectoral (Hashim et al., 2013). Al inicio del estudio (día 0) la carne presentó mayor oxidación de lípidos que en el día 7, ya que los LOOH formados inicialmente son descompues tos en aldehídos y otras sustancias de descompo sición de las grasas, las cuales se acumulan afec tando las características organolépticas (Richards et al., 2002; Chaijan, 2008). El tratamiento sin adi ción de orégano en la dieta (C) presentó un mayor índice de peróxidos en el día 0 que los demás tra tamientos, disminuyendo el índice de peróxidos en la medida que aumenta la inclusión de oréga no en la dieta de los pollos. Así, los tratamientos de inclusión de orégano seco en la dieta de 3,75% y 5% presentaron un menor índice de peróxidos inicial comparado con los otros tratamientos (P < 0,05). No se presentaron diferencias significativas (P > 0,05) entre tratamientos en el día 7. Lo mismo ocurrió en el estudio realizado por Botsoglou et al. (2002), en el que se incluyó AE de orégano a la dieta en dosis de 50 y 100 mg kg-1, obtenien do una respuesta en la capacidad antioxidante en la carne, medida mediante la concentración de malondialdehído durante el almacenamiento en refrigeración, situación que se repite en carne de cordero alimentados con una suplementación de AE de orégano mezclado con el concentrado (1 mL kg -1 de concentrado) (Simitzis et al., 2008).
Recuento de aerobios mesófilos (RAM)
El recuento total de aerobios mesófilos du rante el almacenamiento de carne de pollos ali mentados con dietas con orégano se presenta en la Fig. 2. Se observa que en los días 0 y 3 de alma cenamiento en refrigeración el RAM fue menor hasta el día 7, donde aumentó considerablemente en todos los tratamientos. Sin embargo, el RAM determinado en este estudio está dentro del lí mite exigido por el Reglamento Sanitario de los Alimentos (RSA) (DS N° 977/96. 1997), en el cual se exige un RAM máximo de 107 en carne cruda. Nieto et al. (2010) también observaron un aumento del RAM durante la refrigeración de carne de ovejas alimentadas con dietas con sustitución de un 10 y 20% de su dieta basal con pellets fabricados con 50% de cebada más 50% de romero, sin presentar diferencias significativas (P > 0,05) en el RAM entre tratamientos, por lo tanto, no se ob tuvo un efecto antimicrobiano en la carne pollo al incluir orégano seco en la dieta. Esto podría de berse a que los compuestos activos del orégano, el carvacrol y timol, que debieran conferir actividad antibacteriana y antifúngica, se transformarían durante el metabolismo en el hígado de animales monogástricos, conjugándose con ácido glucurónico u otras sustancias endógenas del organismo, facilitando su excreción (Numpaque et al., 2011; García-García y Palou-García, 2008).
Por consiguiente, una forma más eficaz para controlar el crecimiento microbiano en la carne sería aplicarlo directamente sobre la carne de po llo o incluir el AE de orégano en envases activos, logrando así una concentración que permita la inhibición del crecimiento bacteriano (Velasco y Williams, 2011), como fue demostrado para hí gado de pollo envasado adicionando EDTA, en atmósfera modificada, EDTA en atmósfera modi ficada, EDTA en atmósfera modificada más 0,1% de aceite de orégano y EDTA en atmósfera mo dificada más 0,3% de aceite de orégano, pues los tratamientos que incluyeron aceite de orégano tu vieron una vida útil, basado en el análisis senso rial, de 14 a 15 días, mientras que los tratamientos de atmósfera modificada y EDTA más atmósfera modificada solo de 7 a 9 días (Hasapidou y Savvaidis, 2011).
Parámetros de color
Los parámetros de color de la carne de pollo en los días 0, 3 y 7 de almacenamiento se mues tran en las Tabla 2. El color de la carne depende principalmente del estado de oxidación de la mioglobina, la cual contiene hierro, si se oxida forma otro pigmento color marrón denominado metamioglobina (Faustman et al., 2010). En la carne el hierro se encuentra en la forma hemo, ca racterizada por su mayor facilidad de absorción y biodisponibilidad, sin embargo, en la carne de pollo es menos abundante (Gil, 2010).
Los cortes de carne analizados en este estudio presentan diferencias de color, debido a que el contenido de mioglobina es superior en el muslo en comparación con el músculo pectoral (Cori et al., 2014). En la Tabla 2 se puede apreciar que en el músculo pectoral no hubo diferencias significati vas (P > 0,05) entre tratamientos en los parámetros de color al inicio del estudio (día 0). Sin embargo, en muslos de pollo se presentaron diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre tratamientos en el día 0 en el parámetro b* (intensidad de amarillo), encontrándose un mayor valor en el tratamiento de menor inclusión de orégano (1,25%) y en el tratamiento de mayor inclusión de orégano (5%). En el valor del croma y ángulo de tono también se presentaron diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre tratamientos en el muslo al día 0, presentan do valores mayores el tratamiento de 5%. Quiao et al. (2002) establecieron como parámetros de L* para carne de ave normal, valores 48 < L* < 51; carne pálida, blanda y exudativa, L* > 53; y carne oscura, firme y seca, L* < 46. En el presente ensayo los valores de L* fueron mayores a 48, lo cual co rresponde a valores entre carne de ave normal y carne pálida, blanda y exudativa, sin diferencias significativas (P ≥ 0,05) entre tratamientos.
L*: Luminosidad; a*: Intensidad de rojo; b*: Intensidad de amarillo; C*: Croma; h: Ángulo de tono; AE: Diferencia de color con respecto al tratamiento control.
Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos según Duncan (P < 0,05).
En el día 0 las diferencias de color (AE) con respecto al tratamiento control (C) estuvieron en tre 1,8 y 4,6. Para que las diferencias de color sean perceptibles por el ojo humano, deben ser supe riores a 5 ó 6 AE. Sólo una persona bien prepara da percibe diferencias de 3 ó 4 AE (LaCie, 2006). Por lo tanto, las diferencias obtenidas en este es tudio, no serían perceptibles por los consumido res al inicio del almacenamiento. En el día 3 de almacenamiento en refrigeración no se observa ron diferencias significativas (P > 0,05) en el color entre tratamientos, y las diferencias de color (AE) fueron menores a 5. El día 7 de almacenamiento en refrigeración en el músculo pectoral se presen taron diferencias significativas (P ≤ 0,05) en la lu minosidad L*, siendo mayor en el tratamiento de 3,75%. Diferencias de color perceptibles con res pecto al tratamiento control fueron obtenidas en el músculo pectoral de los tratamientos de mayor inclusión de orégano en la dieta (3,75 y 5%). No se observaron diferencias significativas (P > 0,05) en el color del muslo entre tratamientos al día 7. Sin embargo, las diferencias de color con respec to al tratamiento control (∆E) fueron mayores a 5 en los tratamientos 2,5 y 5%. Du et al. (2000) en contró un efecto de la suplementación de ácido linoleico conjugado en la dieta de pollos en con centraciones de 1,25; 2,5; y 5% en los valores de L* de la carne después de 7 días de almacenamiento, siendo de 56,6; 55,6; y 53,2, respectivamente.
En el estudio realizado por Simitzis et al. (2010), los parámetros de color de carne de cerdos alimentados con suplemento dietético de AE de orégano en concentraciones de 0,25; 0,5; y 1 mL kg-1 no se vieron afectados significativamente. En estudios anteriores realizados en corderos y ca britos con inclusión de orégano seco en la dieta desde 1 a 5%, tampoco se observaron diferencias significativas en los parámetros de color L*, a* y b* de la carne cruda. Sin embargo, en dichos es tudios no se evaluó el color de la carne durante el período de almacenamiento (Velasco et al., 2010; Velasco et al., 2011).
Composición nutricional
La composición nutricional de la carne de po llo del músculo pectoral y del muslo se presenta en la Tabla 3. El contenido de agua de la carne del
músculo pectoral se encontró en el rango de 68,9 a 84%, y en muslos entre 69 y 71%; siendo simila res a los valores obtenidos por Wattanachat et al. (2004) en pollos broilers. La carne de pollo tiene aproximadamente entre 16 y 25% de proteínas (Gil, 2010). En este estudio el contenido de pro teínas del músculo pectoral osciló en el rango de 12,78 a 17,75%, y en muslos entre 13,97 y 16,97%, siendo menor en ambos casos a lo reportado por Wattanachat et al. (2004) con valores promedio de 20,59% en músculo pectoral y 19,08% en muslos. Según Gil (2010), el porcentaje de grasa o extrac to etéreo (EE) debería encontrarse entre un 5-10% en carnes magras y 10-30% en carnes grasas; por lo cual esta carne se puede clasificar como car ne magra. El porcentaje de minerales (Se, Zn, Cu, Mg, Co, P, Cr, Ni y Fe en forma orgánica "hemo") determinado en las cenizas, concuerda con lo obtenido por Wattanachant et al. (2004) de aproximadamente 1%. En un estudio realizado en carne de ovinos se observó un aumento en el extracto etéreo (contenido de lípidos) con suple-mentación de orégano en la dieta de los animales en un 1% comparado con el tratamiento control (Velasco et al., 2010). Esto indicaría una posible modificación del metabolismo de lípidos en los animales, lo cual requiere realizar otros estudios.
Evaluación sensorial.
En la Tabla 4 se presentan los resultados de la evaluación sensorial de la carne. Esta evaluación se realizó en el músculo pectoral (pechuga), ya que es un corte más homogéneo para ser presentado a los jueces. El color fue evaluado entre los valores 2-3 correspondiente a blanco amarillento y amarillo (Tabla 1). No se presentaron diferen cias significativas (P > 0,05) en los parámetros de color entre los tratamientos con suplementación de orégano y el control. La intensidad del aroma del tratamiento control fue calificada con un va lor 4, indicando una intensidad de aroma baja, y los tratamiento con suplementación de oréga no fueron calificados con un valor de 3, corres pondiente a una intensidad de aroma moderada (Tabla 1). La aceptación general fue menor en el tratamiento control (Me disgusta) y mayor en los tratamientos con suplementación de oréga no (Me es indiferente y Me gusta). Esto indica que la característica de intensidad de aroma po dría afectar la aceptación de la carne, entre otras características sensoriales no evaluadas en este estudio, como jugosidad y textura. Hasapidou y Savvaidis (2011) al incorporar AE de orégano sobre la carne identificaron transferencia de sa bores y olores desagradables en concentraciones de 0,1%, razón por la cual recomiendan que su uso directo sea en concentraciones bajas. Estos resultados también concuerdan con Chouliara et al. (2007), quienes evaluaron el efecto combinado de atmósfera modificada y 1% o 0,1% de AE de orégano, obteniendo carne con mayor vida útil, pero de sabor y olor no aceptable en la concen tración más alta.
CONCLUSIONES
La carne de pollos alimentados con dietas su plementadas con orégano seco presentó menor oxidación de lípidos al inicio del almacenamien to en refrigeración. Diferencias de color (∆E) perceptibles por el ojo humano entre la carne de los tratamientos con mayor inclusión de orégano en la dieta (2,5-5%) y el control se presentan a los siete días de almacenamiento. La suplemen-tación de orégano seco en la dieta de pollos no tuvo un efecto antimicrobiano en la carne. La carne de pollos alimentados con suplementación de orégano seco (1,25-5%) es aceptada por el con sumidor y su mayor estabilidad al inicio del al macenamiento está dada por la menor oxidación de lípidos.